Колониеобразующая единица - Colony-forming unit

Для гемопоэтических клеток человека см. Гематопоэтические стволовые клетки.

А колониеобразующая единица (КОЕ, КОЕ, КОЕ) - единица, используемая в микробиология оценить количество жизнеспособный бактерии или же грибковый ячеек в образце. Жизнеспособность определяется как способность размножаться за счет двойное деление в контролируемых условиях. Подсчет колониеобразующими единицами требует культивирования микробов и подсчета только жизнеспособных клеток, в отличие от микроскопического исследования, при котором подсчитываются все клетки, живые или мертвые. Внешний вид колонии в клеточной культуре требует значительного роста, и при подсчете колоний неясно, возникла ли колония из одной клетки или из группы клеток. Выражение результатов в виде колониеобразующих единиц не различает.

Теория

Разбавление с бактериями и одурманенный вода помещается в Чашка агара (Количество чашек с агаром для образцов продуктов питания или Триптиказо-соевый агар для клинических образцов) и распределите по пластине, наклоняя ее, как показано на рисунке.

Целью подсчета на чашке является оценка количества присутствующих клеток на основе их способности давать рост колонии в определенных условиях питательной среды, температуры и времени. Теоретически одна жизнеспособная клетка может дать начало колония через репликацию. Однако одиночные клетки являются исключением в природе, и, скорее всего, прародителем колонии была масса клеток, депонированных вместе.[нужна цитата ] Кроме того, многие бактерии растут цепочками (например, Стрептококк ) или комков (например, Стафилококк ). Оценка микробного числа с помощью КОЕ в большинстве случаев занижает количество живых клеток, присутствующих в образце по этим причинам. Это связано с тем, что подсчет КОЕ предполагает, что каждая колония является отдельной и основана на одной жизнеспособной микробной клетке.[1]

Количество тарелок линейно для Кишечная палочка в диапазоне от 30 до 300 КОЕ на стандартном размере чашка Петри.[2] Следовательно, чтобы гарантировать, что образец будет давать КОЕ в этом диапазоне, требуется разведение образца и посев нескольких разведений. Как правило, используются десятикратные разведения, и серии разведений наносят на чашки в двух или трех экземплярах в выбранном диапазоне разведений. Часто на чашки высевают 100 мкл, но также используются большие количества - до 1 мл. Более высокие объемы покрытия увеличивают время сушки, но часто не приводят к более высокой точности, поскольку могут потребоваться дополнительные этапы разбавления.[3] КОЕ / планшет считывается с планшета в линейном диапазоне, а затем КОЕ / г (или КОЕ / мл) исходного рассчитывается математически, с учетом нанесенного количества и его коэффициента разбавления (например, CLSI VET01S ).

Раствор бактерий неизвестной концентрации часто серийно разбавленный чтобы получить хотя бы одну чашку со счетным количеством бактерий. На этом рисунке пластина «x10» подходит для счета.

Преимущество этого метода заключается в том, что разные виды микробов могут давать рост колоний, которые явно отличаются друг от друга, причем оба вида микроскопически и макроскопически. В морфология колонии могут быть очень полезны при идентификации присутствующих микроорганизмов.[нужна цитата ]

Предварительное понимание микроскопической анатомии организма может дать лучшее понимание того, как наблюдаемые КОЕ / мл соотносятся с количеством жизнеспособных клеток на миллилитр. В качестве альтернативы в некоторых случаях можно уменьшить среднее количество клеток на КОЕ на встряхивание образец перед проведением разбавления. Однако многие микроорганизмы являются хрупкими и страдают от уменьшения доли жизнеспособных клеток при помещении в вихрь.[нужна цитата ]

Обозначение журнала

Концентрации колониеобразующих единиц могут быть выражены с использованием логарифмической записи, где указанное значение является логарифм по основанию 10 концентрации.[4][5][6] Это позволяет сокращение журнала из процесс дезактивации вычисляется как простое вычитание.

Использует

Колониеобразующие единицы используются для количественной оценки результатов во многих микробиологических методах посева и подсчета, включая:

  • Метод Pour Plate, при котором образец суспендируют в чашке Петри с использованием расплавленного агара, охлажденного примерно до 40-45 ° C (чуть выше точки затвердевания, чтобы минимизировать гибель клеток, вызванную нагреванием). После застывания питательного агара планшет инкубируют.[7]
  • Метод распределения на чашках, при котором образец (в небольшом объеме) распределяют по поверхности чашки с питательным агаром и дают высохнуть перед инкубацией для подсчета.[7]
  • Метод мембранного фильтра, при котором образец фильтруют через мембранный фильтр, затем фильтр помещают на поверхность чашки с питательным агаром (бактериями вверх). Во время инкубации питательные вещества просачиваются через фильтр, поддерживая рост клеток. Поскольку площадь поверхности большинства фильтров меньше, чем у стандартной чашки Петри, линейный диапазон подсчета на чашке будет меньше.[7]
  • В Методы Майлза и Мишры или метод капельной чашки, при котором очень небольшая аликвота (обычно около 10 микролитров) образца из каждого разведения в серии капают в чашку Петри. Чашку-каплю необходимо считывать, пока колонии очень малы, чтобы предотвратить потерю КОЕ по мере их совместного роста.[нужна цитата ]

Однако с помощью методов, требующих использования чашки с агаром, нельзя использовать жидкий раствор, потому что чистоту образца нельзя не идентифицировать, и невозможно подсчитать клетки в жидкости по одной.[8]

Инструменты для подсчета колоний

Традиционный способ подсчета КОЕ с помощью «счетчика щелчков» и ручки. Когда колоний слишком много, обычно считают КОЕ только на части чашки.

Подсчет колоний традиционно выполняется вручную с помощью ручки и счетчика щелчков. Обычно это простая задача, но она может стать очень трудоемкой и отнимать много времени, когда необходимо перечислить много пластин. В качестве альтернативы можно использовать полуавтоматические (программные) и автоматические (аппаратные + программные) решения.[нужна цитата ]

Программное обеспечение для подсчета КОЕ

Колонии можно подсчитать по фотографиям тарелок с помощью программных средств. Экспериментаторы обычно фотографируют каждую тарелку, которую им нужно посчитать, а затем анализируют все изображения (это можно сделать с помощью простой цифровой камеры или даже веб-камеры). Поскольку для получения одного снимка требуется менее 10 секунд, в отличие от нескольких минут для подсчета КОЕ вручную, такой подход обычно экономит много времени. Кроме того, он более объективен и позволяет извлекать другие переменные, такие как размер и цвет колоний.

  • OpenCFU[1] это бесплатно и с открытым исходным кодом программа, разработанная для повышения удобства, скорости и надежности. Он предлагает широкий спектр фильтров и элементов управления, а также современный пользовательский интерфейс. OpenCFU написан на C ++ и использует OpenCV для анализа изображений.[9]
  • ОТЛИЧНО это программа, написанная на MATLAB это обеспечивает простой способ подсчета колоний по изображениям.[10][11]
  • ImageJ и CellProfiler: Некоторые макросы ImageJ[12] и плагины и некоторые конвейеры CellProfiler[13] можно использовать для подсчета колоний. Это часто требует от пользователя изменения кода для достижения эффективного рабочего процесса, но может оказаться полезным и гибким. Одна из основных проблем - отсутствие конкретных GUI что может сделать взаимодействие с алгоритмами обработки утомительным.

В дополнение к программному обеспечению, основанному на традиционных настольных компьютерах, доступны приложения для устройств Android и iOS для полуавтоматического и автоматического подсчета колоний. Встроенная камера используется для фотографирования чашки с агаром, а внутренний или внешний алгоритм используется для обработки данных изображения и оценки количества колоний. [14][15][16][17]

Автоматизированные системы

Многие автоматизированные системы используются для противодействия человеческая ошибка поскольку многие методы исследования, проводимые людьми для подсчета отдельных клеток, имеют высокую вероятность ошибки. Из-за того, что исследователи регулярно вручную подсчитывают клетки с помощью проходящего света, этот метод, подверженный ошибкам, может существенно повлиять на расчетную концентрацию в основной жидкой среде, когда количество клеток мало.

Автоматический счетчик колоний с использованием обработки изображений.

Полностью автоматизированные системы также доступны от некоторых производителей биотехнологии.[18][19] Они, как правило, дороги и не так гибки, как автономное программное обеспечение, поскольку оборудование и программное обеспечение предназначены для совместной работы в определенных условиях.[нужна цитата ]В качестве альтернативы некоторые автоматические системы используют спиральное покрытие парадигма.[нужна цитата ]

Некоторые автоматизированные системы, такие как системы MATLAB, позволяют подсчитывать клетки без необходимости их окрашивания. Это позволяет повторно использовать колонии для других экспериментов без риска уничтожения микроорганизмов пятнами. Однако недостатком этих автоматизированных систем является то, что чрезвычайно трудно отличить микроорганизмы с пылью или царапинами на пластинах с кровяным агаром, потому что и пыль, и царапины могут создавать самые разнообразные комбинации форм и внешнего вида.[20]

Альтернативные единицы

Вместо колониеобразующих единиц параметры Наиболее вероятное число (MPN) и модифицированные единицы Фишмана (MFU)[нужна цитата ] может быть использован. Метод наиболее вероятного числа подсчитывает жизнеспособные клетки и полезен при подсчете низких концентраций клеток или подсчете микробов в продуктах, в которых наличие твердых частиц делает подсчет на чашке нецелесообразным.[21] В модифицированных единицах Фишмана учитываются жизнеспособные, но не культивируемые бактерии.[нужна цитата ]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Гольдман, Эмануэль; Грин, Лорренс Х (24 августа 2008 г.). Практическое руководство по микробиологии, второе издание (электронная книга Google) (Второе изд.). США: CRC Press, Taylor and Francis Group. п. 864. ISBN  978-0-8493-9365-5. Получено 2014-10-16.
  2. ^ Порода RS, Dotterrer WD (май 1916 г.). «Число колоний, допустимых на удовлетворительных чашках с агаром». Журнал бактериологии. 1 (3): 321–31. Дои:10.1128 / JB.1.3.321-331.1916. ЧВК  378655. PMID  16558698.
  3. ^ Schug, Angela R .; Бартель, Александр; Мерер, Марита; Scholtzek, Anissa D .; Бромбах, Джулиан; Хенсель, Вивиан; Фаннинг, Саймус; Шварц, Стефан; Фесслер, Андреа Т. (01.12.2020). «Сравнение двух методов определения количества клеток в ходе тестирования чувствительности к биоцидам». Ветеринарная микробиология. 251: 108831. Дои:10.1016 / j.vetmic.2020.108831.
  4. ^ «Log10 колониеобразующих единиц на грамм». Энциклопедия Тити Тудоранча. Получено 25 сентября, 2016.
  5. ^ Дэниел Ю. К. Фунг (2009). «Количество жизнеспособных клеток». Bioscience International. Получено 25 сентября, 2016.
  6. ^ Мартин Коул (1 ноября 2005 г.). «Принципы микробиологического тестирования: статистические основы отбора проб» (PDF). Международная комиссия по микробиологическим спецификациям пищевых продуктов (ICMSF). Архивировано из оригинал (PDF) 31 октября 2017 г.. Получено 25 сентября, 2016.
  7. ^ а б c «Фармакопея США 61: Подсчет микроорганизмов» (PDF). Фармакопея США. Получено 24 марта 2015.[постоянная мертвая ссылка ]
  8. ^ Рейнольдс, Джеки. «Протоколы последовательного разбавления». www.microbelibrary.org. Архивировано из оригинал на 2015-11-17. Получено 2015-11-15.
  9. ^ Гейссманн Q (2013). «OpenCFU, новое бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для подсчета колоний клеток и других круглых объектов». PLOS ONE. 8 (2): e54072. Дои:10.1371 / journal.pone.0054072. ЧВК  3574151. PMID  23457446.
  10. ^ https://www.nist.gov/pml/div686/sources_detectors/nice.cfm[требуется полная цитата ]
  11. ^ Кларк М.Л., Бертон Р.Л., Хилл А.Н., Литоржа М., Нахм М.Х., Хван Дж. (Август 2010 г.). «Недорогой, высокопроизводительный, автоматизированный подсчет колоний бактерий». Цитометрия Часть А. 77 (8): 790–7. Дои:10.1002 / cyto.a.20864. ЧВК  2909336. PMID  20140968.
  12. ^ Cai Z, Chattopadhyay N, Liu WJ, Chan C, Pignol JP, Reilly RM (ноябрь 2011 г.). «Оптимизированный цифровой подсчет колоний в клоногенных анализах с использованием программного обеспечения ImageJ и настроенных макросов: сравнение с ручным подсчетом». Международный журнал радиационной биологии. 87 (11): 1135–46. Дои:10.3109/09553002.2011.622033. PMID  21913819. S2CID  25417288.
  13. ^ Вокес М.С., Карпентер А.Е. (апрель 2008 г.). Использование CellProfiler для автоматической идентификации и измерения биологических объектов на изображениях. Текущие протоколы в молекулярной биологии. Глава 14. С. Раздел 14.17. Дои:10.1002 / 0471142727.mb1417s82. ISBN  978-0471142720. ЧВК  4302752. PMID  18425761.
  14. ^ "Счетчик колоний Промега". Магазин приложений. Получено 2018-09-28.
  15. ^ "APD Colony Counter App PRO - Приложения в Google Play". play.google.com. Получено 2018-09-28.
  16. ^ Аустерхост, Йонас; Марквард, Даниэль; Раддац, Лукас; Гейер, Доминик; Беккер, Томас; Шепер, Томас; Линднер, Патрик; Бейтель, Саша (август 2017 г.). «Приложение для интеллектуального устройства для автоматического определения колоний E. coli на чашках с агаром». Инженерия в науках о жизни. 17 (8): 959–966. Дои:10.1002 / elsc.201700056. ISSN  1618-0240. ЧВК  6999497. PMID  32624845.
  17. ^ «Объем КОЕ». Магазин приложений. Получено 2018-09-28.
  18. ^ «Счетчики колоний: роботизированный счетчик колоний - манипулятор тарелок». www.neutecgroup.com. Получено 2018-09-28.
  19. ^ "Полностью автоматический счетчик колоний от AAA Lab Equipment Video | LabTube". www.labtube.tv. Получено 2018-09-28.
  20. ^ Brugger, Silvio D .; Баумбергер, Кристиан; Йост, Марсель; Дженни, Вернер; Brugger, Urs; Мюлеманн, Катрин (2012-03-20). «Автоматический подсчет бактериальных колониеобразующих единиц на чашках с агаром». PLOS ONE. 7 (3): e33695. Дои:10.1371 / journal.pone.0033695. ISSN  1932-6203. ЧВК  3308999. PMID  22448267.
  21. ^ «Руководство по анализу бактерий: наиболее вероятное число из серийных разведений». Соединенные Штаты Управление по контролю за продуктами и лекарствами. Октябрь 2010 г.

дальнейшее чтение