Электрофорез в свободном потоке - Free-flow electrophoresis

Электрофорез в свободном потоке (FFE), также известный как электрофорез без носителей, является безматричной электрофоретический техника разделения. FFE - метод, аналогичный капиллярный электрофорез, с сопоставимым разрешением, которое можно использовать для научных вопросов, где необходимы полупрепаративные и препаративные количества образцов. Он используется для количественного разделения образцов в соответствии с различиями в заряде или изоэлектрической точке. Из-за универсальности метода существует широкий спектр протоколов разделения образцов, таких как редкий металл ионы, белок изоформы, мультипротеиновые комплексы, пептиды, органеллы, клетки, ДНК оригами, сыворотка крови и наночастицы существовать. Преимущество FFE заключается в быстром и щадящем разделении образцов, растворенных в жидком растворителе, без необходимости использования матрицы, например полиакриламид в гель-электрофорез. Это обеспечивает очень высокую скорость извлечения, поскольку аналиты не прилипают к какой-либо структуре носителя или матрицы. Благодаря своей непрерывной природе и высокой пропускной способности этот метод позволяет быстро разделить подготовительные количества образцов с очень высоким разрешением. Кроме того, разделения можно проводить в естественных или денатурирующих условиях.[1]

История

FFE был разработан в 1960-х Куртом Ханнигом из Института Макса Планка в Германии.[2] До 1980-х годов это была стандартизованная технология разделения клетки и органеллы, и FFE даже был испытан в космосе, чтобы минимизировать осаждение под нулем сила тяжести.[3] В качестве проточной цитометрии стал стандартным методом сортировки клеток, разработки FFE были сосредоточены на разделении белков и заряженных частиц. Некоторые группы также работают над миниатюрными версиями систем FFE или микро FFE.[4]

Техника

Разделительная камера состоит из задней и передней пластин. Задняя панель обычно представляет собой охлаждаемый алюминиевый блок, покрытый пластиковым стеклянным зеркалом. Передняя панель в настоящее время изготавливается из ПММА, раньше использовалось стекло. Расстояние между передней и задней панелями можно отрегулировать с помощью проставок и обычно составляет от 0,1 до 0,5 мм. На передней панели также находятся входы для разделительных буферов и образца, выходы для пробирок фракционирования и платиновые проволоки в качестве электродов. Применяя различные буферы к множеству входных отверстий для буфера, оператор может изменять pH, концентрацию соли или состав и, следовательно, условия разделения по ширине камеры. Буферы разделения и образец наносятся перистальтические насосы, чтобы обеспечить ламинарный поток. Высокое напряжение электрическое поле наносится перпендикулярно ламинарному потоку. Аналиты в ламинарном потоке могут быть разделены плотность заряда и / или изоэлектрическая точка. Из-за своей универсальной природы этот метод может использовать различные режимы электрофореза, такие как, например, изотахофорез, изоэлектрическое фокусирование или (интервальный) зонный электрофорез.

В конце ячейки для разделения отделенный образец разделяется в трубках для фракционирования и собирается на микротитровальных планшетах.[5]

Схема функциональных возможностей электрофореза в свободном потоке

После этого образцы можно охарактеризовать всеми основными методами, такими как ВЭЖХ, ЖХ-МС, масс-спектрометрии (ESI / МАЛДИ, в зависимости от используемого протокола) или электрофореза (IEF / СТРАНИЦА SDS, 2D-СТРАНИЦА ).

Приложения

Стандартное применение включает разделение с высоким разрешением белковых комплексов, мембранных белков, изоформ белков и антител, клеток, субклеточных компартментов (таких как органеллы, рибосомы) и липосом.[6] За счет использования очень плоских градиентов pH, создаваемых амфолиты, можно разделить изоформы белка, которые изменяются менее чем на 0,02 единицы pH, с производительностью около 3 мг / ч.[7]Также можно добавлять добавки к буферам, чтобы увеличить разрешение или денатурировать образцы. Обычно концентрации мочевины до 8M, 0,1-1% моющих средств, таких как: CHAPS, CHAPSO, дигитонин, додецил-ß-D-мальтозид, октил-ß-D-глюкозид, тритон-X-114 (IEF) и DTT до 50 мМ допустимы.

Ключевая особенность

  • Безматричное разделение, идеально для сохранения активности белка / белковых комплексов
  • Разделение с высоким разрешением белковых комплексов, мембранных белков, изоформ белков, клеток, субклеточных компартментов (таких как органеллы, рибосомы и т. Д.),
  • Диапазон размеров разделения от ионов до целых ячеек
  • Извлечение образца до 99%, в зависимости от образца и режима работы
  • Высокая воспроизводимость отдельных прогонов
  • Разделение за несколько минут
  • Протоколы разделения изоэлектрической фокусировки с различными коммерческими амфолитами и атоксичными низкомолекулярными ProLytesTM для прямого клинического применения
  • Быстрое и чувствительное определение качества разделения с помощью УФ- и IEF-гелей
  • Совместим со многими другими последующими технологиями, например ВЭЖХ, МС, SDS-, IEF- и 2D-GE
  • Подходит для разделения нестабильных белков за счет охлаждения образцов и камеры разделения до 4 ° C
  • Снижение сложности протеома перед дальнейшим протеомным анализом [8]
  • Обогащение белков с низким содержанием за счет удаления избытка нежелательных белков
  • Совместимость с большими и малыми объемами образцов от 50 мкл до нескольких миллилитров.
  • Подготовительный и аналитический режимы работы
  • Поддерживает все режимы электрофоретического разделения (IEF, IZE, ZE, ITP)
  • Может работать в естественных или денатурирующих условиях


Рекомендации

  1. ^ П.Д. Патель и Г. Вебер, Электрофорез в свободной жидкости: обзор технологии и применения в сельском хозяйстве, J. Biol. Phys. Chem. 2003, 3, 60–73.
  2. ^ Электрофорез в свободном потоке, Курт Ханниг и Ханс Г. Гейдрих, GIT Verlag 1990, ISBN  3-921956-88-9
  3. ^ Электрофорез в космосе - 1985, PDF
  4. ^ С. Езерски, Л. Гитлин, С. Нагл, Д. Бельдер, Многоступенчатая жидкофазная литография для быстрого прототипирования микрожидкостных микросхем для электрофореза в свободном потоке, Anal. Биоанал. Chem., 2011, 401, 2651-2656.
  5. ^ «Принцип разделения FFE». Архивировано из оригинал на 2014-12-01. Получено 2013-06-04.
  6. ^ Применение электрофореза в свободном потоке
  7. ^ [1]
  8. ^ Islinger, M; Eckerskorn, C; Фёлькль, А (2010). "Электрофорез в свободном потоке в протеомную эру: техника в движении". Электрофорез. 31: 1754–63. Дои:10.1002 / elps.200900771. PMID  20506416.

внешняя ссылка