Анализ защиты гентамицина - Gentamicin protection assay

В анализ защиты от гентамицина или анализ выживаемости или анализ вторжения это метод, используемый в микробиология. Он используется для количественной оценки способности патогенный бактерии вторгаться эукариотические клетки.

Этот анализ основан на нескольких наблюдениях, сделанных в 1970-х годах, в которых способность интернализованных бактерий избегать убийства путем антибиотики Сообщалось.[1][2] Анализ начали использовать в биологические исследования в начале 1980-х гг.

Предпосылки и принцип

Необходимо проникновение внутриклеточных бактерий клетки-хозяева (клетки из зараженный организм ) чтобы копировать и распространять инфекцию. Многие виды Шигелла (причины бактериальная дизентерия ), Сальмонелла (брюшной тиф ), Микобактерии (проказа и туберкулез ) и Листерия (листериоз ), и это лишь некоторые из них, являются внутриклеточными.

Некоторые антибиотики не могут проникнуть в эукариотические клетки. Следовательно, эти антибиотики не могут повредить уже усвоенные внутриклеточные бактерии. Использование таких антибиотиков позволяет нам различать бактерии, которым удается проникнуть в эукариотические клетки, и бактерии, которым это не удается. Применяя такой антибиотик к культура эукариотических клеток, инфицированных бактериями, убьет бактерии, которые остаются вне клеток, при сохранении тех, которые проникли. Антибиотик выбора для этого анализа - аминогликозид гентамицин.

Процедура

Химическая структура гентамицина

HeLa клетки обычно используются в качестве эукариотических клеток в анализе защиты от гентамицина, но могут быть использованы и другие клетки. Что касается бактерий, можно анализировать только те виды, которые чувствительны к гентамицину.

Анализ проводится в пластике. микротитрационные планшеты, которые обычно используются в лаборатории для культивирования эукариотических клеток. Клеткам дают возможность расти в лунках в течение ночи, создавая плоский слой. Бактерии выращивают отдельно в течение ночи. На следующий день эукариотические клетки привитый с бактериями и инкубируют вместе в течение часа. Центрифугирование пластины на несколько минут могут помочь клеткам и бактериям контактировать и вызвать инфекцию.

После заражения в чашки добавляют гентамицин и инкубируют в течение часа, позволяя антибиотику убить все бактерии, которые не смогли проникнуть в клетки и остались снаружи. Затем планшеты хорошо промывают, чтобы удалить мертвые бактерии. Затем эукариотические клетки лизированный с помощью моющее средство, Наиболее часто Тритон Х-100.

Бактерии, которые проникли в клетки и остались живыми, теперь высвобождаются, и они помещаются на твердые средние тарелки. Подсчет колоний, образовавшихся на чашках на следующий день, и знание того, сколько бактерий было использовано в начале анализа, позволяет исследователю рассчитать процент бактерий, которые смогли проникнуть в эукариотические клетки.

Использование, преимущества и предостережения

Анализ защиты от гентамицина обычно используется в исследованиях патогенов. Вклад конкретных гены или белки способность бактерий проникать в клетки можно легко оценить с помощью этого метода. Рассматриваемый ген может быть выбит, и инвазивность бактерий по сравнению с нормальными, дикого типа бактерии. Условия окружающей среды, такие как pH уровень и температура, также могут быть проанализированы их влияние на инвазивность.

Анализ защиты от гентамицина очень чувствителен, так как он может обнаруживать интернализацию даже отдельных бактерий. У него есть несколько недостатков:

  • Гентамицин иногда может проникать в эукариотические клетки и убивать интернализованные бактерии. Это может произойти, если проницаемость количество клеток каким-то образом увеличивалось во время анализа, иногда из-за плохого обращения с клетками.
  • Интернализованные бактерии иногда могут быть не полностью защищены от внешней среды, например, когда фагосома (в вакуоль окружает бактерию внутри клетки) каким-то образом неисправен. Гентамицин может убить эти бактерии.
  • Гентамицин может не убить все бактерии, оставшиеся вне клеток.

Чтобы помочь оценить точность конкретного анализа, положительный и отрицательный контроль должен быть выполнен. При выполнении анализа, как описано выше, в анализ должны быть включены бактерии, которые известны как полностью инвазивные (положительный контроль), и бактерии, которые известны как неинвазивные (отрицательный контроль).

Альтернативный анализ инвазии - это дифференциальный иммуноокрашивание анализ, основанный на связывании антитела бактериям до и после инвазии. Антитела выделяют флуоресцентный, цветные свет, а результаты этого анализа отображаются под микроскоп.

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Манделл Г.Л. (1973). «Взаимодействие внутрилейкоцитарных бактерий и антибиотиков». J Clin Invest. 52 (7): 1673–1679. Дои:10.1172 / JCI107348. ЧВК  302442. PMID  4718959.
  2. ^ Vaudaux P и Waldvogel FA (1979). «Антибактериальная активность гентамицина в присутствии полиморфно-ядерных лейкоцитов человека». Противомикробные агенты Chemother. 16 (6): 743–749. Дои:10.1128 / aac.16.6.743. ЧВК  352946. PMID  533256.