РНКаза H-зависимая ПЦР - RNase H-dependent PCR

Рисунок 1: механизм rhPCR.

РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР)[1] является модификацией стандарта ПЦР техника. В рчПЦР праймеры конструируются со съемным блоком амплификации на 3 ’конце. Амплификация заблокированного праймера зависит от активности расщепления гипертермофильный архей Тип II РНКаза H фермент во время гибридизации с комплементарной целевой последовательностью. Этот фермент РНКаза Н обладает несколькими полезными характеристиками, улучшающими ПЦР. Во-первых, он имеет очень низкую ферментативную активность при низкой температуре, что позволяет «горячий старт ПЦР »Без изменений ДНК-полимераза. Во-вторых, эффективность расщепления фермента снижается при наличии несовпадений рядом с остатком РНК. Это позволяет сократить димер праймера формирование[1], обнаружение альтернативное сращивание варианты,[2][3] способность выполнять мультиплексная ПЦР с большим количеством праймеров ПЦР и способностью обнаруживать однонуклеотидные полиморфизмы.[4]

Принцип

rhPCR грунтовки состоят из трех разделов. 1) 5’-участок ДНК, эквивалентный по длине и температуре плавления (Tm) стандартному праймеру для ПЦР, удлиняется после расщепления ферментом РНКаза HII. 2) Одно основание РНК обеспечивает сайт расщепления для РНКазы HII. 3) Короткое 3’-удлинение из четырех или пяти оснований, за которым следует блокатор (обычно короткая, нерастяжимая молекула, такая как пропандиол ) предотвращает удлинение ДНК-полимеразой до удаления. Реакция rhPCR начинается с праймеров и матрицы в растворе (рис. 1). Находясь в свободном состоянии в растворе, эти праймеры не деблокируются ферментом РНКаза HII, поскольку они должны находиться в гетеродуплексе РНК: ДНК с матрицей, которую необходимо расщепить. После связывания с матрицей праймеры rhPCR расщепляются термостабильным ферментом РНКазой HII. Это удаляет блок, позволяя ДНК-полимеразе выходить за пределы праймеров. Цикл реакции ПЦР продолжает процесс. Праймеры rhPCR сконструированы таким образом, что после расщепления ферментом РНКазой H2 Tm праймеров все еще превышает температуру отжига реакции ПЦР. Эти праймеры можно использовать как в 5’-нуклеазе Такман и SYBR Зеленый виды количественная ПЦР.

Приложения

rhPCR может использоваться для количественная ПЦР и медицинские или экологические лаборатории:

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Добосы Дж. Р., Роуз С. Д., Бельц К. Р., Рупп С. М., Пауэрс К. М., Бельке М. А., Вальдер Дж. А. (август 2011 г.). «РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): улучшенная специфичность и обнаружение однонуклеотидного полиморфизма с использованием блокированных расщепляемых праймеров». BMC Biotechnology. 11: 80. Дои:10.1186/1472-6750-11-80. ЧВК  3224242. PMID  21831278.
  2. ^ Гордон, Эрин Д .; Симпсон, Лаура Дж .; Риос, Сидни Л .; Рингель, Ландо; Lachowicz-Scroggins, Marrah E .; Питерс, Майкл С .; Весоловска-Андерсен, Агата; Гонсалес, Жанмари Р .; MacLeod, Hannah J .; Christian, Laura S .; Юань, Шаопэн; Барри, Лиам; Вудрафф, Прескотт Дж .; Ансель, К. Марк; Нока, Карл; Seibold, Max A .; Фахи, Джон В. (2 августа 2016 г.). «Альтернативный сплайсинг интерлейкина-33 и воспаления 2 типа при астме». Труды Национальной академии наук. 113 (31): 8765–8770. Дои:10.1073 / pnas.1601914113.
  3. ^ Boucard, Antony A .; Максайнер, Стефан; Зюдхоф, Томас К. (3 января 2014 г.). «Латрофилины функционируют как гетерофильные молекулы клеточной адгезии путем связывания с теневринами. РЕГУЛИРОВАНИЕ АЛЬТЕРНАТИВНЫМ СПЛИСИНГОМ». Журнал биологической химии. 289 (1): 387–402. Дои:10.1074 / jbc.M113.504779.
  4. ^ Cahoon, A .; Наусс, Джон; Стэнли, Коннер; Куреши, Али (20 февраля 2017 г.). «Глубокое секвенирование транскриптома двух зеленых водорослей, Chara vulgaris и Chlamydomonas reinhardtii, не дает доказательств редактирования органеллярной РНК». Гены. 8 (2): 80. Дои:10.3390 / genes8020080. ЧВК  5333069. PMID  28230734.