TCP-seq - TCP-seq

Последовательность сложных профилей перевода (TCP-seq) это молекулярная биология метод получения снимков мгновенного распределения комплексов синтеза белка по информационная РНК (мРНК) цепи.^[1]

Заявление

Выражение генетический код во всех формах жизни состоит из двух основных процессов, синтеза копий генетического кода, записанного в ДНК, в форму мРНК (транскрипция ), так и сам синтез белка (перевод ), в результате чего копии кода в мРНК декодируются в аминокислотные последовательности соответствующих белков. И транскрипция, и трансляция - это строго регулируемые процессы, по сути контролирующие все, что происходит в живых клетках (и, следовательно, в многоклеточных организмах).

Контроль перевода особенно важен в эукариотический ячейки, где он является частью посттранскрипционный регуляторный сети экспрессии генов. Эта дополнительная функциональность отражена в повышенная сложность процесса перевода, что делает его трудным для исследования. Тем не менее подробности о том, когда и какая мРНК транслируется и какие механизмы отвечают за этот контроль, являются ключом к пониманию нормальной и патологической функциональности клеток. Для получения этой информации можно использовать TCP-seq.

Принципы

С появлением высокопроизводительная идентификация последовательностей ДНК и РНК методы (такие как Секвенирование Illumina ), стало возможным эффективно анализировать нуклеотидные последовательности большого количества относительно коротких фрагментов ДНК и РНК. Последовательности этих фрагментов могут быть наложены друг на друга, чтобы восстановить источник. В качестве альтернативы, если исходная последовательность уже известна, фрагменты могут быть найдены в ней («нанесены на карту») и подсчитаны их индивидуальные номера. Таким образом, если существует начальная стадия, на которой фрагменты по-разному присутствуют или выбираются («обогащены»), этот подход можно использовать для количественного описания такой стадии даже на очень большом количестве или длине входных последовательностей, чаще всего охватывающих всю ДНК. или РНК клетки.

TCP-seq основан на этих возможностях высокопроизводительного секвенирования РНК и дополнительно использует явление защиты нуклеиновой кислоты. Защита проявляется как устойчивость к деполимеризации или модификации участков нуклеиновых кислот (в частности, РНК), которые прочно связаны или поглощены другими биомолекулами, которые, таким образом, оставляют свои «следы» на цепи нуклеиновой кислоты. Таким образом, эти «следовые» фрагменты представляют собой место на цепи нуклеиновой кислоты, где происходит взаимодействие. Посредством секвенирования и сопоставления фрагментов с исходной последовательностью можно точно идентифицировать местоположения и количество этих межмолекулярных контактов.

В случае TCP-seq, рибосомы и рибосомные субъединицы, участвующие во взаимодействии с мРНК, сначала быстро химически сшитый к нему с формальдегидом, чтобы сохранить существующее состояние взаимодействий («снимок» распределения) и заблокировать любые возможные неравновесные процессы. Сшивание можно проводить непосредственно в живых клетках, но не ограничиваясь ими. Затем РНК частично разлагается (например с рибонуклеаза ), так что остаются только фрагменты, защищенные рибосомами или рибосомными субъединицами. Затем защищенные фрагменты очищают в соответствии с осаждение динамика прикрепленных рибосом или рибосомных субъединиц, деблокированных, секвенированных и сопоставленных с источником транскриптом, что дает исходное расположение комплексов трансляции над мРНК.

TCP-seq объединяет несколько элементов, типичных для других транскриптомный анализ в своем роде. Особенно, полисомное профилирование^[2][3] и профилирование рибосом (перевод)^[4] подходы также используются для идентификации мРНК, участвующей в полисом образование и расположение удлиняющихся рибосом над кодирующими участками транскриптов соответственно. Эти методы, однако, не используют химическую стабилизацию трансляционных комплексов и очистку ковалентно связанных промежуточных продуктов из живых клеток. Таким образом, TCP-seq можно рассматривать скорее как функциональный эквивалент ChIP-seq и аналогичные методы исследования мгновенных взаимодействий ДНК, которые были переработаны, чтобы быть применимыми для трансляции.

Преимущества и недостатки

К достоинствам метода можно отнести:

• уникально широкое поле зрения (поскольку трансляционные комплексы любого типа, в том числе сканирующие небольшие субъединицы рибосом, захватываются впервые);
• потенциально более естественное представление сложной динамики (потому что все, а не только отдельные, трансляционные процессы останавливаются фиксацией формальдегида);
• возможно более точное и / или чувствительное определение местоположения комплексов трансляции (поскольку ковалентная фиксация предотвращает отрыв фрагментов от рибосом или их субъединиц).

К недостаткам можно отнести:

• более высокая общая сложность экспериментальной процедуры (из-за необходимости первоначального выделения транслируемой мРНК и препаративного осаждения для разделения рибосом и рибосомных субъединиц);
• более высокая степень загрязнения полезной глубины считывания секвенирования нежелательными фрагментами рибосомной РНК (унаследованная от окна выбора большого размера, используемого для защищенных фрагментов РНК);
• предварительное требование для оптимизации процедуры фиксации формальдегида для каждой новой ячейки или типа образца (поскольку оптимальное время фиксации формальдегида сильно зависит от морфологии образца, и как чрезмерная, так и недостаточная фиксация могут ухудшить результаты).

Разработка

В настоящее время метод находится в разработке и был применен для исследования динамики перевода в реальном времени. дрожжи ячеек и расширяет, а не просто объединяет возможности предыдущих методов.^[1] Единственный другой транскриптомный метод картирования положений рибосом по мРНК с нуклеотидной точностью - это профилирование рибосом (трансляция). Однако он захватывает позиции только удлиняющихся рибосом, и большинство динамических и функционально важных промежуточных продуктов трансляции на стадии инициации не обнаруживаются.

TCP-seq был разработан специально для этих слепых зон. По сути, он может обеспечивать такой же уровень детализации для фазы элонгации, что и профилирование рибосомы (трансляции), но также включает запись промежуточных продуктов инициации, терминации и рециклинга (и в основном любых других возможных трансляционных комплексов, пока рибосома или ее субъединицы контактируют и защищают мРНК) синтеза белка, который ранее оставался недоступным. Таким образом, TCP-seq обеспечивает единый подход для полного понимания процесса трансляции биологического образца. Можно ожидать, что этот конкретный аспект метода получит дальнейшее развитие, поскольку динамика рибосомного сканирования мРНК во время инициации трансляции, как правило, неизвестна в течение большей части жизни. Текущий набор данных, содержащий данные TCP-seq для инициации трансляции, доступен для дрожжей Saccharomyces cerevisiae,^[5][6] и, вероятно, будет распространен на другие организмы в будущем.

Рекомендации