Анализ заживления ран - Wound healing assay

Эксперимент по заживлению ран от царапин рабдомиосаркома, линия раковых клеток.

А проба на заживление ран это лабораторный метод, используемый для изучения миграция клеток и межклеточное взаимодействие. Это также называется скретч-анализ потому что это делается путем нанесения царапины на ячейку монослой и получение изображений через равные промежутки времени с помощью покадрового микроскопа.[1][2]

Это, в частности, двухмерный подход к миграции клеток для полуколичественного измерения миграции клеток в листе клеток.[3] Эта царапина может быть получена различными способами, например механическими, термическими или химическими повреждениями.[4] Цель этой царапины - создать область, свободную от клеток, в надежде побудить клетки к миграции и закрыть разрыв. Царапающий тест идеально подходит только для типов клеток, которые мигрируют как коллективные эпителиальные пласты, и не подходит для неприлипающих клеток.[3] В частности, этот анализ не идеален для хемотаксис исследования.[5]

Преимущества и недостатки

Этот лабораторный метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, эти тесты относительно дешевы, относительно просты и позволяют проводить измерения в реальном времени.[3] Кроме того, условия тестирования можно легко настроить для соответствия различным экспериментальным целям.[2] Этот подход также обеспечивает сильную направленную миграционную реакцию, что упрощает количественную оценку данных.[2]

Одним из ограничений этого анализа является то, что могут быть несоответствия с глубиной и размером царапины. Когда царапина выполняется вручную, края могут быть «неровными», что затрудняет анализ данных.[6] Кроме того, повреждение может физически повредить клетки, прилегающие к ране, и создать области неточного размера раны.[3] Это ограничение постепенно становится менее важной проблемой для автоматизированных технологий. Тесты определения сопротивления электрических клеток используются для предотвращения повреждения клеток в нижележащем внеклеточном матриксе, которое, вероятно, может произойти при использовании ручного царапания.[3] Кроме того, Woundmaker делает быстрые и однородные раны на различных пронумерованных лунках планшетов (96 или 384) и позволяет проводить высокопроизводительный скрининг, что является основным преимуществом для различных медицинских исследований.[3]

Несмотря на новую технологию, повышающую точность и эффективность этого анализа, все еще существуют мешающие факторы, которые могут исказить результаты анализа, такие как «скопление» клеток, эффекты клеточной адгезии и матричные эффекты.[5] Кроме того, все еще упоминается проблема скопления клеток на краю царапины, что делает плотность клеток неравномерной.[7]

Некоторые скептики думают, что царапина, созданная для анализа, не является очень точным отображением реальной раны.[2] Это очень вероятно, так как настоящие раны по своей сути более сложны, но этот анализ действительно позволяет коллективное движение клеток в определенных экспериментальных условиях, чтобы дать некоторое представление.[2]

Несмотря на то, что метод описывался как простой, он подвергался критике из-за несоответствий в его применении от одного эксперимента к другому.[8][2]

Стандартный лабораторный протокол

Изложен стандартный подход к проведению этого анализа без использования передовых технологий:[5]

  1. Поместите выбранные клетки в питательной среде в чашку для визуализации живых клеток или предметное стекло. Важно обеспечить образование монослоя, поскольку сгустки будут давать неточные результаты из-за неравномерной плотности клеток. Необходимо титрование клеток для определения оптимальной плотности покрытия.
  2. Когда слияние клеток станет идеальным, используйте кончик пипетки, чтобы поцарапать рану по всему центру лунки. Как упоминалось ранее, именно здесь потенциальное несоответствие вступает в игру с этим анализом. Если царапина сделана вручную, важно убедиться, что рана видна с обеих сторон поля зрения и должна иметь ширину около 0,5 мм.
  3. Затем клетки можно поместить в микроскоп с относительным объективом 20x.
  4. Начните покадровую микроскопию и настройте параметры в соответствии с разнообразием исследуемых клеток. Быстрорастущим ячейкам могут потребоваться более короткие интервалы времени для получения более точной скорости ячейки.

Приложения

  • Количественный / качественный анализ коллективной миграции клеток в меняющихся экспериментальных условиях.[2]
  • Анализ клеточного матрикса и межклеточного взаимодействия в отношении миграции клеток.[2]
  • Грохоты с высокой пропускной способностью для:[2]
    • Гены миграции раковых клеток
    • Маленькие молекулы
    • Открытие наркотиков

Метрики для количественной оценки миграции клеток

Скорость миграции клеток:[2]

куда
рM = Скорость миграции клеток
Wя = Начальная ширина раны
Wж = Окончательная ширина раны
t = продолжительность миграции

Относительная плотность раны:[2]

куда
шт = Плотность раны в момент времени t
cт = Плотность площади ячейки в момент времени t

Выше приведены основные показатели, которые можно измерить с помощью этого анализа. Однако все еще предпринимаются попытки улучшить интерпретацию этого анализа. Были оценены три различных измерения: прямая средняя скорость, средняя скорость регрессии и средняя дистанционная регрессия.[9] Средняя скорость регрессии и средняя скорость регрессии были более устойчивы к выбросам, тогда как средняя скорость регрессии была более чувствительна к выбросам.[9]

Миграция клеток

Царапина - отличный инструмент для изучения миграция клеток поскольку этот механизм задействован во многих различных физиологических аспектах.[7] Миграция клеток играет огромную роль в реэпителизации кожи, поэтому изучение миграции клеток может способствовать развитию понимания незаживающих ран.[7] Миграция клеток также играет фундаментальную роль в процессах развития, таких как гаструляция и органогенез.[9] Миграция клеток также участвует в иммунных ответах и ​​метастазах рака.[7]

Биология рака

Благодаря технологическому прогрессу этот анализ становится очень полезным, особенно в области биологии рака. Было проведено исследование, чтобы лучше понять роль, которую клаудин-7, семейство белков плотного соединения, играет в миграции клеток в одном из типов клеток рака легких человека.[10] Из-за более медленной скорости миграции клеток с нокдауном клаудина-7 это подтверждает идею о том, что этот белок важен для миграции клеток, способности клетки метастазировать.[10] Клетки подвергаются миграции листов из-за множества сигналов и механизмов при попытке закрыть рану, что, как полагают, похоже на лежащие в основе механизмы, участвующие в метастазировании.[4]

Альтернативы анализу заживления ран

Использование устройств для визуализации живых клеток без этикеток на основе количественная фазовая визуализация, было показано, что подвижность клеток сильно коррелирует с заживлением ран и результатами трансвеллентного анализа. Преимущество этого полностью автоматизированного подхода заключается в том, что количественная оценка подвижности клеток не требует специальной подготовки образца, что позволяет распространение клеток для одновременной количественной оценки.[11][12]

Рекомендации

  1. ^ Родригес Л.Г., Ву Х, Гуань Дж.Л. (2005). «Ранозаживляющая проба». Методы молекулярной биологии. 294: 23–9. Дои:10.1385/1-59259-860-9:023. ISBN  1-59259-860-9. PMID  15576902. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  2. ^ а б c d е ж грамм час я j k Града А, Отеро-Винас М, Прието-Кастрилло Ф, Обаги З, Фаланга V (февраль 2017 г.). «Простые методы исследования: анализ коллективной миграции клеток с использованием метода заживления ран». Журнал следственной дерматологии. 137 (2): e11 – e16. Дои:10.1016 / j.jid.2016.11.020. PMID  28110712.
  3. ^ а б c d е ж Берроуз А., Пирсон HB, Пулио Н. (2013). Исследование метастазов с использованием платформ in vitro. Landes Bioscience.
  4. ^ а б Джонкман Дж. Э., Кэткарт Дж. А., Сюй Ф., Бартолини М. Е., Амон Дж. Э., Стивенс К. М., Коларуссо П. (октябрь 2014 г.). «Введение в анализ заживления ран с использованием микроскопии живых клеток». Адгезия и миграция клеток. 8 (5): 440–51. Дои:10.4161 / cam.36224. ЧВК  5154238. PMID  25482647.
  5. ^ а б c Кори Джи (2011). «Анализ царапин». Методы молекулярной биологии. 769: 25–30. Дои:10.1007/978-1-61779-207-6_2. ISBN  978-1-61779-206-9. PMID  21748666. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  6. ^ De Ieso ML, Pei JV (октябрь 2018 г.). «Точный и экономичный альтернативный метод измерения миграции клеток с помощью метода циркулярного закрытия ран». Отчеты по бионауке. 38 (5): BSR20180698. Дои:10.1042 / BSR20180698. ЧВК  6209583. PMID  30232234.
  7. ^ а б c d Ван Моуритцен М, Йенсен Х (август 2018 г.). «Оптимизированный анализ царапин для тестирования миграции клеток in vitro с помощью автоматической оптической камеры». Журнал визуализированных экспериментов (138). Дои:10.3791/57691. ЧВК  6126681. PMID  30148500.
  8. ^ Джонкман Дж. Э., Кэткарт Дж. А., Сюй Ф., Бартолини М. Е., Амон Дж. Э., Стивенс К. М., Коларуссо П. (сентябрь 2014 г.). «Введение в анализ заживления ран с использованием микроскопии живых клеток». Адгезия и миграция клеток. 8 (5): 440–51. Дои:10.4161 / cam.36224. ЧВК  5154238. PMID  25482647.
  9. ^ а б c Диллон П.К., Ли Х, Санес Дж. Т., Акинтола О.С., Сан Б. (июнь 2017 г.). «Сравнение методов для анализа скорости заживления ран». Биохимия и клеточная биология. 95 (3): 450–454. Дои:10.1139 / bcb-2016-0163. HDL:1807/78300. PMID  28177756.
  10. ^ а б Kim DH, Lu Q, Chen YH (март 2019 г.). «Клаудин-7 модулирует адгезию клеточного матрикса, которая контролирует миграцию клеток, инвазию и прикрепление клеток рака легких человека HCC827». Письма об онкологии. 17 (3): 2890–2896. Дои:10.3892 / ол.2019.9909. ЧВК  6365970. PMID  30854065.
  11. ^ Чжан, Юньтянь; Джадсон, Роберт Л. (ноябрь 2018 г.). «Оценка приложений подвижности голомонитора M4 цитометра голографической визуализации». Цитометрия Часть А. 93 (11): 1125–1131. Дои:10.1002 / cyto.a.23635.
  12. ^ Цзэн, Ханьлинь; Джорапур, Апарна; Шаин, А. Хантер; Lang, Ursula E .; Торрес, Родриго; Чжан, Юньтянь; МакНил, Эндрю С .; Боттон, Томас; Линь, Цзюэ; Донн, Мэтью; Bastian, Ingmar N .; Ю, Ричард; North, Джеффри П .; Пинкус, Лаура; Ruben, Beth S .; Джозеф, Нэнси М .; Ага, Ивэй; Бастиан, Борис Ц .; Джадсон, Роберт Л. (июль 2018 г.). «Биаллельная потеря CDKN2A вызывает инвазию меланомы через активацию BRN2». Раковая клетка. 34 (1): 56–68.e9. Дои:10.1016 / j.ccell.2018.05.014.