Спектроскопия ядерно-магнитного резонанса нуклеиновых кислот - Википедия - Nuclear magnetic resonance spectroscopy of nucleic acids

ЯМР нуклеиновой кислоты это использование спектроскопия ядерного магнитного резонанса получить информацию о структуре и динамике нуклеиновая кислота молекулы, такие как ДНК или же РНК. Это полезно для молекул длиной до 100 нуклеотидов, и по состоянию на 2003 год почти половина всех известных структур РНК была определена с помощью ЯМР-спектроскопии.[1]

ЯМР имеет преимущества перед Рентгеновская кристаллография, который является другим методом для определение структуры нуклеиновой кислоты, в том, что молекулы наблюдаются в их естественном решение государство, а не в кристаллическая решетка что может повлиять на структурные свойства молекулы. Также можно исследовать динамику с помощью ЯМР. Это происходит за счет немного менее точных и подробных структур, чем кристаллография.[2]

ЯМР нуклеиновых кислот использует методы, аналогичные методам белок ЯМР, но имеет несколько отличий. Нуклеиновые кислоты имеют меньший процент атомов водорода, которые обычно наблюдаются в ЯМР, и потому что двойные спирали нуклеиновых кислот жесткие и примерно линейные, они не складываются сами по себе, создавая «дальнодействующие» корреляции. Нуклеиновые кислоты также имеют тенденцию иметь резонансы, распределенные в меньшем диапазоне, чем белки, что делает спектры потенциально более насыщенными и трудными для интерпретации.[3]

Экспериментальные методы

Двумерный ЯМР методы почти всегда используются с нуклеиновыми кислотами. К ним относятся корреляционная спектроскопия (COSY) и спектроскопия передачи полной когерентности (TOCSY) для обнаружения ядерных взаимодействий через сквозные связи, а также ядерный эффект Оверхаузера спектроскопия (NOESY) для обнаружения взаимодействий между ядрами, которые находятся близко друг к другу в космосе. Типы ЯМР, обычно выполняемые с нуклеиновыми кислотами: 1H ЯМР, 13C ЯМР, 15N ЯМР, и 31P ЯМР. 19F ЯМР также полезно, если неприродные нуклеотиды, такие как 2'-фтор-2'-дезоксиаденозин включены в цепь нуклеиновой кислоты, поскольку природные нуклеиновые кислоты не содержат атомов фтора.[2][4]

1Рука 31P имеют около 100% природное изобилие, пока 13C и 15N имеют низкое естественное содержание. Для этих последних двух ядер существует возможность изотопного обогащения желаемых атомов в молекулах либо равномерно, либо сайт-специфическим образом. Нуклеотиды, равномерно обогащенные 13C и / или 15N можно получить биохимическими методами, выполнив полимеразной цепной реакции с помощью dNTP или NTP получены из бактерий, выращенных в среде, обогащенной изотопами. Сайт-специфичное обогащение изотопов должно осуществляться путем химического синтеза меченых нуклеозид фосфорамидит мономер и полной пряди; однако их сложно и дорого синтезировать.[1][5]

Поскольку нуклеиновые кислоты имеют относительно большое количество протонов, которые могут обмениваться растворителем, ЯМР нуклеиновых кислот обычно не проводят. D2О растворитель, как и другие типы ЯМР. Это потому, что дейтерий в растворителе заменит обмениваемые протоны и погасит их сигнал. ЧАС2О используется в качестве растворителя, и другие методы используются для устранения сильного сигнала растворителя, такие как насыщение сигнала растворителя перед нормальной последовательностью импульсов («предварительное насыщение»), что лучше всего работает при низкой температуре для предотвращения обмена протонов насыщенного растворителя. с протонами нуклеиновой кислоты; или возбуждение только интересующих резонансов («избирательное возбуждение»), что имеет дополнительный, потенциально нежелательный эффект искажения амплитуд пиков.[2]

Определение структуры

Обмениваемые и необмениваемые протоны обычно относят к их конкретным пикам как две независимые группы. Для обменных протонов, которые по большей части являются протонами, участвующими в базовая пара, NOESY можно использовать для поиска корреляций в пространстве между соседними основаниями, что позволяет назначить всю дуплексную молекулу через последовательная ходьба. Для необмениваемых протонов, многие из которых находятся на сахарном фрагменте нуклеиновой кислоты, COSY и TOCSY используются для идентификации систем связанных ядер, в то время как NOESY снова используется для корреляции сахара с основанием и каждого основания с соседним основанием. Для необмениваемых протонов дуплексной ДНК протоны H6 / H8 на основании коррелируют со своими аналогами на соседних основаниях и с протоном H1 'на сахаре, что позволяет выполнять последовательную ходьбу. Для РНК различия в химической структуре и геометрии спирали делают это отнесение технически более трудным, но все же возможным. Методология последовательной ходьбы невозможна ни для структур нуклеиновых кислот, не являющихся двойной спиралью, ни для Z-ДНК форма, затрудняющая присвоение резонансов.[2][3]

Параметры, взятые из спектра, в основном кросс-пики NOESY и константы связи, может использоваться для определения местных структурных особенностей, таких как гликозидная связь углы, двугранные углы (с использованием Уравнение Карплюса ) и конформации сахарной складки. Наличие или отсутствие имино-протонных резонансов или связи между 15Атомы N через водородную связь указывает на наличие или отсутствие спаривания оснований. Для крупномасштабной структуры эти локальные параметры должны быть дополнены другими структурными допущениями или моделями, потому что ошибки складываются при прохождении двойной спирали, и, в отличие от белков, двойная спираль не имеет компактной внутренней части и не сворачивается назад. сам. Однако информацию об ориентации на большие расстояния можно получить с помощью остаточная дипольная связь эксперименты в среде, которая накладывает слабое выравнивание на молекулы нуклеиновой кислоты.[1][2]

Недавно, твердотельный ЯМР внедрена методика определения структуры нуклеиновых кислот.[6] Протокол предполагает два подхода: селективное мечение нуклеотидного типа РНК и использование экспериментов по гетероядерной корреляции.

ЯМР также полезен для исследования нестандартных геометрий, таких как изогнутые спирали, не-Ватсона – Крика, и коаксиальная укладка. Это было особенно полезно при исследовании структуры природных олигонуклеотидов РНК, которые имеют тенденцию принимать сложные конформации, такие как стебель-петли и псевдоузлы. Взаимодействия между РНК и ионами металлов можно исследовать с помощью ряда методов, включая наблюдение изменений химического сдвига при связывании иона, наблюдение уширения линии для парамагнитных типов ионов и наблюдение межмолекулярных контактов NOE для металлоорганических имитаторов ионов металлов. ЯМР также полезен для исследования связывания молекул нуклеиновой кислоты с другими молекулами, такими как белки или лекарства. Это можно сделать с помощью карты химического сдвига, которая позволяет увидеть, какие резонансы сдвигаются при связывании другой молекулы, или с помощью экспериментов по перекрестному насыщению, когда одна из связывающих молекул селективно насыщается, и, если она связана, насыщение переходит на другую. молекула в комплексе.[1][2]

Динамические свойства, такие как равновесие между дуплексом и одной цепью и скорости связывания других молекул с дуплексами, также могут быть определены по его влиянию на спин-решеточная релаксация время Т1, но эти методы нечувствительны к промежуточным скоростям 104–108 s−1, которые необходимо исследовать другими методами, такими как твердотельный ЯМР. Динамика механических свойств двойной спирали нуклеиновой кислоты, таких как изгиб и скручивание, также может быть изучена с помощью ЯМР. Градиент импульсного поля ЯМР-эксперименты можно использовать для измерения константы диффузии.[1][2][7]

История

ЯМР-исследования нуклеиновых кислот проводились еще в 1971 г.[8] и сосредоточился на использовании имино-протонных резонансов в слабом поле для исследования взаимодействий спаривания оснований. Эти ранние исследования были сосредоточены на тРНК, потому что эти нуклеиновые кислоты были единственными доступными в то время образцами с достаточно низкой молекулярной массой, чтобы значения ширины спектральных линий ЯМР были практичными. Исследование было сосредоточено на протонах с низким полем, потому что они были единственными протонами, которые можно было надежно наблюдать в водном растворе с помощью лучших спектрометров, доступных в то время. Быстро стало понятно, что спектры имино-протонов в слабом поле дают ключ к пониманию третичной структуры тРНК в растворе. Первый спектр ЯМР двойной спирали ДНК был опубликован в 1977 г.[9] с использованием синтетической двойной спирали из 30 пар оснований. Чтобы преодолеть резкое уширение линий в нативной ДНК, была приготовлена ​​полностью деградированная природная ДНК и изучена, чтобы узнать о длине персистентности двойной спиральной ДНК.[10] В то же время были изучены ядра нуклеосомных частиц, чтобы лучше понять гибкость двойной спирали.[11] Первые спектры ЯМР для однородной низкомолекулярной ДНК с нативной последовательностью, полученные с использованием рестрикционные ферменты, было сообщено в 1981 году.[12] Эта работа также была первым отчетом о спектрах ЯМР нуклеиновых кислот, полученных в сильном поле. Сообщения об исследованиях двумерного ЯМР начали поступать в 1982 г.[13] а затем, с появлением синтез олигонуклеотидов и более сложное оборудование, начиная с 1983 года было опубликовано множество подробных структурных исследований.[14]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е Фюртиг, Борис; Рихтер, Кристиан; Wöhnert, Jens; Швальбе, Харальд (2003). «ЯМР-спектроскопия РНК». ChemBioChem. 4 (10): 936–962. Дои:10.1002 / cbic.200300700. PMID  14523911.
  2. ^ а б c d е ж грамм Wemmer, Дэвид (2000). «Глава 5: Структура и динамика ЯМР». В Блумфилде, Виктор А .; Crothers, Donald M .; Тиноко, Игнасио (ред.). Нуклеиновые кислоты: структура, свойства и функции. Саусалито, Калифорния: Научные книги университета. ISBN  0-935702-49-0.
  3. ^ а б Addess, Kenneth J .; Фейгон, Джули (1996). "Введение в 1H ЯМР-спектроскопия ДНК ». In Hecht, Sidney M. (ed.). Биоорганическая химия: нуклеиновые кислоты. Нью-Йорк: Oxford University Press. ISBN  0-19-508467-5.
  4. ^ Кан, Лу-пой; Ц'О, Пол О. П. (1986). "Ядерно-магнитный резонанс нуклеиновых кислот". В Чиен, Шу; Хо, Чиен (ред.). ЯМР в биологии и медицине. Нью-Йорк: Raven Press. ISBN  0-88167-231-9.
  5. ^ Кодзима, C; Оно, А; Оно, А; Кайносё, М (2002). «Твердофазный синтез селективно меченой ДНК: приложения для многомерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса». Методы в энзимологии. 338: 261–283. Дои:10.1016 / S0076-6879 (02) 38224-7. PMID  11460552.
  6. ^ Марчанка, Александр; Саймон, Бернд; Альтхофф-Оспельт, Герхард; Карломаньо, Тереза ​​(2015). «Определение структуры РНК методом твердотельной ЯМР-спектроскопии». Nature Communications. 6: 7024. Bibcode:2015НатКо ... 6Э7024М. Дои:10.1038 / ncomms8024. ЧВК  4432599. PMID  25960310.
  7. ^ Robinson, B.H .; Дробный, Г. (1995). «[19] Сайт-специфическая динамика в ДНК: теория и эксперимент». Ядерный магнитный резонанс и нуклеиновые кислоты. Методы в энзимологии. 261. С. 451–509. Дои:10.1016 / S0076-6879 (95) 61021-9. ISBN  978-0-12-182162-3. ISSN  0076-6879.
  8. ^ Кирнс, Дэвид; Патель, Диншоу; Шульман, Роберт (1971). "Ядерно-магнитные резонансные исследования высокого разрешения протонов тРНК в воде с водородной связью". Природа. 229: 338–339. Bibcode:1971 г., природа, 229..338 тыс.. Дои:10.1038 / 229338a0.
  9. ^ Рано, Томас; Кирнс, Дэвид; Берд, Джон; Ларсон, Жаклинн; Уэллс, Роберт (1977). «Исследование структурных и динамических свойств d (C15A15) · d (T15G15) с помощью протонного ядерного магнитного резонанса высокого разрешения». Биохимия. 16 (3): 541–551. Дои:10.1021 / bi00622a031.
  10. ^ Рано, Томас; Кернс, Дэвид (1979). «Исследование гибкости ДНК с помощью ядерного магнитного резонанса 1H». PNAS. 76 (9): 4165–4169. Bibcode:1979PNAS ... 76.4165E. Дои:10.1073 / пнас.76.9.4165. ЧВК  411531. PMID  291958.
  11. ^ Фейгон, Юли; Кернс, Дэвид (1979). «Исследование конформационных состояний ДНК в ядрах нуклеосом с помощью ЯМР 1H». Исследования нуклеиновых кислот. 6: 2327–2337. Дои:10.1093 / nar / 6.6.2327. ЧВК  327853. PMID  461191.
  12. ^ Рано, Томас; Кирнс, Дэвид; Хиллен, Вольфганг; Уэллс, Роберт (1980). «Исследование протонным ЯМР 300 МГц и 600 МГц рестрикционного фрагмента из 12 пар оснований: исследование структуры путем релаксационных измерений». Исследования нуклеиновых кислот. 8: 5795–5812. Дои:10.1093 / nar / 8.23.5795. ЧВК  324342. PMID  6258152.
  13. ^ Фейгон, Юли; Райт, Джон; Леупен, Вернер; Денни, Вашингтон; Кернс, Дэвид (1982). «Использование двумерного ЯМР в исследовании двухцепочечной ДНК». Варенье. Chem. Soc. 104 (20): 5540–5541. Дои:10.1021 / ja00384a069.
  14. ^ Адрес, Кеннет; Фейгон, Джули (1996). «Введение в 1H ЯМР-спектроскопию ДНК». В Hecht, Сидней (ред.). Биоорганическая химия: нуклеиновые кислоты. Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. ISBN  0-19-508467-5.