Гель-электрофорез в импульсном поле - Pulsed-field gel electrophoresis

Микробиолог проводит тест на гель-электрофорез в импульсном поле, используемый при типировании бактерий.

Гель-электрофорез в импульсном поле это техника, используемая для разделения больших ДНК молекулы обратившись в гель матрица электрическое поле который периодически меняет направление.[1][2]

Историческое прошлое

Стандарт гель-электрофорез методы разделения молекул ДНК дали огромные преимущества для исследований в области молекулярной биологии. Однако он не смог эффективно разделить очень большие молекулы ДНК. Молекулы ДНК размером более 15–20 т.п.н., мигрирующие через гель, будут перемещаться вместе независимо от размера. В Колумбийский университет в 1984 г. Дэвид С. Шварц и Чарльз Кантор разработал вариант стандартного протокола, введя чередование градиент напряжения для улучшения разрешения более крупных молекул.[3]Этот метод стал известен как гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE). Разработка PFGE расширила диапазон разрешения для фрагментов ДНК на два порядка.

Процедура

Кластерный анализ в BioNumerics энтероагрегативных штаммов Escherichia coli по отпечаткам пальцев с помощью гель-электрофореза в импульсном поле

Процедура этого метода относительно аналогична выполнению стандартного гель-электрофореза, за исключением того, что вместо того, чтобы постоянно пропускать напряжение в одном направлении, напряжение периодически переключается между тремя направлениями; одна проходит через центральную ось геля, а две - под углом 60 градусов с каждой стороны. Время импульсов одинаково для каждого направления, что приводит к чистой прямой миграции ДНК. Для очень больших молекул (примерно до 2 Мбит / с) можно использовать линейные изменения интервала переключения, которые увеличивают время импульса для каждого направления в течение нескольких часов - например, линейное увеличение импульса с 10 секунд при 0 часов до 60 секунд в 18 часов.

Эта процедура занимает больше времени, чем обычный гель-электрофорез из-за размера разделяемых фрагментов и того факта, что ДНК не движется по прямой линии через гель.

Теория

Хотя в целом небольшие фрагменты могут проходить через гелевый матрикс легче, чем большие фрагменты ДНК, существует пороговая длина более 30–50 т.п.н., когда все большие фрагменты будут проходить с одинаковой скоростью и проявляться в геле в виде одного большого диффузного группа.

Однако при периодическом изменении направления поля ДНК различной длины реагируют на изменение с разной скоростью. То есть более крупные фрагменты ДНК будут медленнее перестраивать свой заряд при изменении направления поля, тогда как более мелкие фрагменты будут быстрее. С течением времени при последовательном изменении направлений каждая полоса начнет отделяться все больше и больше даже на очень больших участках. Таким образом, становится возможным разделение очень больших фрагментов ДНК с помощью PFGE.

Приложения

PFGE можно использовать для генотипирование или же генетическая дактилоскопия. Обычно считается Золотой стандарт в эпидемиологический исследования патогенных организмов. Подтипы облегчили различение штаммов Listeria monocytogenes и таким образом связать экологические или пищевые изоляты с клиническими инфекциями.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Кауфманн, Мэри Элизабет (1998). «Гель-электрофорез в импульсном поле». Молекулярная бактериология. Методы молекулярной медицины. 15. С. 33–50. Дои:10.1385/0-89603-498-4:33. ISBN  0-89603-498-4. PMID  21390741.
  2. ^ Хершлеб, Джилл; Ананьев, Гена; Шварц, Дэвид C (2007). «Гель-электрофорез в импульсном поле». Протоколы природы. 2 (3): 677–684. Дои:10.1038 / nprot.2007.94. ISSN  1750-2799. PMID  17406630.
  3. ^ Шварц, округ Колумбия, Кантор CR (май 1984 г.). «Разделение дрожжевой ДНК размером с хромосому с помощью гель-электрофореза в градиенте импульсного поля». Клетка. 37 (1): 67–75. Дои:10.1016/0092-8674(84)90301-5. PMID  6373014.

внешняя ссылка