Ферментный анализ - Википедия - Enzyme assay

УФ / видимый спектрофотометр Beckman DU640

Ферментные анализы находятся лаборатория методы измерения ферментативный Мероприятия. Они жизненно важны для изучения кинетика ферментов и ингибирование ферментов.

Ферментные единицы

Количество или концентрация фермента может быть выражена в коренной зуб количества, как и с любым другим химическим веществом, или с точки зрения активности в ферментные единицы.

Ферментная активность

Активность фермента = количество молей субстрата, преобразованных в единицу времени = скорость × реакционный объем. Ферментная активность - это мера количества присутствующего активного фермента и, таким образом, зависит от условий, который следует указать. Единица СИ - это Катал, 1 катал = 1 моль с−1, но это чрезмерно большой блок. Более практичным и часто используемым значением является ферментный блок (U) = 1 мкмоль мин−1. 1 U соответствует 16,67 нанокаталы.[1]

Активность фермента, указанная в katal, обычно относится к предполагаемой природной целевой субстрат фермента. Ферментативная активность также может быть выражена как активность некоторых стандартизованных субстратов, таких как желатин, затем измеряется в установки для переваривания желатина (GDU) или молочные белки, затем измеряются в установки для свертывания молока (MCU). Единицы GDU и MCU основаны на том, насколько быстро один грамм фермента переваривает желатин или молочные белки соответственно. 1 GDU примерно равен 1,5 MCU.[2]

Повышенное количество субстрата увеличит скорость реакции с ферментами, однако по достижении определенной точки скорость реакции выровняется, поскольку количество доступных активных центров остается постоянным.

Специфическая деятельность

Удельная активность фермента - еще одна общая единица. Это активность фермента на миллиграмм общего белка (выраженная в мкмоль мин.−1 мг−1). Удельная активность позволяет определить чистоту фермента в смеси. Это микромоли продукта, образованные фермент в заданное количество времени (минуты) при заданных условиях на миллиграмм общего количества белков. Удельная активность равна скорости реакции, умноженной на объем реакции, деленный на массу общего белка. Единица СИ - катал / кг, но более практичной единицей является мкмоль / мгмин.

Удельная активность - это мера ферментная процессивность (способность фермента перерабатываться) при определенной (обычно насыщающей) субстрат концентрация, и обычно постоянна для чистого фермента.

Процесс титрования активного центра может быть выполнен для исключения ошибок, возникающих из-за различий в партиях культивирования и / или неправильно свернутого фермента и аналогичных проблем. Это мера количества активного фермента, рассчитанная, например, с помощью титрование количества присутствующих активных центров с помощью необратимого ингибитора. Затем следует выразить удельную активность в мкмоль мин.−1 мг−1 активный фермент. Если молекулярный вес фермента известен, номер оборота, или мкмоль продукта в секунду на мкмоль активного фермента, можно рассчитать исходя из удельной активности. Число оборотов можно представить как количество раз, которое каждая молекула фермента выполняет свой каталитический цикл в секунду.

Связанная терминология

В скорость реакции - концентрация субстрата, исчезающего (или производимого продукта) в единицу времени (моль л−1 s−1).

В % чистоты составляет 100% × (удельная активность образца фермента / удельная активность чистого фермента). Неочищенный образец имеет более низкую удельную активность, потому что часть массы на самом деле не является ферментом. Если известна удельная активность 100% чистого фермента, то нечистый образец будет иметь более низкую удельную активность, что позволяет рассчитать чистоту и затем получить четкий результат.

Типы анализа

Все ферменты анализы измерить либо потребление субстрата, либо производство продукта с течением времени.[3] Существует большое количество различных методов измерения концентраций субстратов и продуктов, и многие ферменты можно анализировать несколькими различными способами. Биохимики обычно изучают катализируемые ферментами реакции, используя четыре типа экспериментов:[4]

  • Эксперименты с начальной скоростью. Когда фермент смешивается с большим избытком субстрата, промежуточное соединение фермент-субстрат накапливается с быстрым начальным переходным процессом.[3] Затем реакция достигает стационарной кинетики, при которой промежуточные соединения субстрата фермента остаются примерно постоянными во времени, а скорость реакции изменяется относительно медленно. Скорости измеряются в течение короткого периода времени после достижения квазистационарного состояния, обычно путем мониторинга накопления продукта с течением времени. Поскольку измерения проводятся в течение очень короткого периода времени и из-за большого избытка подложки, можно сделать приближение, что количество свободной подложки приблизительно равно количеству исходной подложки.[5][6] Эксперимент с начальной скоростью является самым простым для выполнения и анализа, поскольку он относительно свободен от таких осложнений, как обратная реакция и разложение ферментов. Поэтому это, безусловно, наиболее часто используемый тип экспериментов по кинетике ферментов.
  • Кривая прогресса экспериментов. В этих экспериментах кинетические параметры определяются из выражений для концентраций компонентов как функции времени. Концентрация субстрата или продукта регистрируется во времени после начального быстрого переходного процесса и в течение достаточно длительного периода, чтобы позволить реакции приблизиться к равновесию. Эксперименты с кривой прогресса широко использовались на раннем этапе изучения кинетики ферментов, но сейчас они менее распространены.
  • Переходные кинетические эксперименты. В этих экспериментах поведение реакции отслеживается во время начального быстрого переходного процесса, когда промежуточный продукт достигает установившегося периода кинетики. Эти эксперименты труднее выполнить, чем любой из двух вышеупомянутых классов, потому что они требуют специальных методов (таких как флэш-фотолиз компаундов в клетке) или быстрое перемешивание (например, остановленный поток, закаленный поток или непрерывный поток).
  • Релаксационные эксперименты. В этих экспериментах равновесная смесь фермента, субстрата и продукта нарушается, например, из-за температура, давление или скачок pH, и отслеживается возврат к равновесию. Анализ этих экспериментов требует рассмотрения полностью обратимой реакции. Более того, эксперименты по релаксации относительно нечувствительны к механистическим деталям и поэтому обычно не используются для идентификации механизма, хотя могут проводиться в соответствующих условиях.

Ферментные анализы можно разделить на две группы в зависимости от метода отбора проб: непрерывные анализы, где анализ дает непрерывное считывание активности, и прерывистые анализы, где отбираются пробы, реакция останавливается, а затем определяется концентрация субстратов / продуктов.

С контролем температуры кювета держатель в спектрофотометре.

Непрерывные анализы

Наиболее удобны непрерывные анализы, при которых один анализ дает скорость реакции без дополнительной работы. Есть много различных типов непрерывных анализов.

Спектрофотометрический

В спектрофотометрический анализов, вы следите за ходом реакции, измеряя изменение количества света, поглощаемого аналитическим раствором. Если этот свет находится в видимой области, вы действительно можете увидеть изменение цвета теста, и это называется колориметрические анализы. В МТТ анализ, окислительно-восстановительный анализ с использованием тетразолиевого красителя в качестве субстрата является примером колориметрического анализа.

Часто используется ультрафиолетовый свет, так как общие коферменты НАДН и НАДФН поглощают ультрафиолетовый свет своими уменьшенный формы, но не в их окисленный формы. An оксидоредуктаза Таким образом, использование НАДН в качестве субстрата может быть проанализировано по уменьшению УФ-поглощения на длине волны 340 нм по мере того, как он потребляет кофермент.[7]

Сравнение прямого и связанного анализов

Комбинированный анализ для гексокиназа с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Даже если ферментативная реакция не приводит к изменению поглощения света, все еще можно использовать спектрофотометрический анализ фермента, используя комбинированный анализ. Здесь продукт одной реакции используется как субстрат другой, легко обнаруживаемой реакции. Например, на рисунке 1 показан сопряженный анализ фермента гексокиназа, который можно оценить, связав выработку глюкозо-6-фосфата с производством НАДФН, используя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Флуорометрический

Флуоресценция это когда молекула излучает свет одного длина волны после поглощения света другой длины волны. Флуорометрические анализы используют разницу во флуоресценции субстрата от продукта для измерения ферментативной реакции. Эти анализы в целом намного более чувствительны, чем спектрофотометрические анализы, но могут страдать от помех, вызванных примесями и нестабильностью многих флуоресцентных соединений при воздействии света.

Примером этих анализов снова является использование нуклеотидных коферментов НАДН и НАДФН. Здесь восстановленные формы являются флуоресцентными, а окисленные формы нефлуоресцентными. Следовательно, за реакциями окисления может следовать снижение флуоресценции, а за реакциями восстановления - ее усиление.[8] Также доступны синтетические субстраты, которые выделяют флуоресцентный краситель в реакции, катализируемой ферментами, например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид для анализа. β-галактозидаза или 4-метилумбеллиферилбутират для анализа Candida rugosa липаза.[9]

Калориметрический

Хемилюминесценция люминола

Калориметрия это измерение тепла, выделяемого или поглощаемого химическими реакциями. Эти анализы являются очень общими, так как многие реакции включают некоторое изменение тепла, а при использовании микрокалориметра не требуется много фермента или субстрата. Эти анализы можно использовать для измерения реакций, которые невозможно проанализировать никаким другим способом.[10]

Хемилюминесцентный

Хемилюминесценция испускание света в результате химической реакции. Некоторые ферментные реакции производят свет, и его можно измерить, чтобы обнаружить образование продукта. Эти типы анализов могут быть чрезвычайно чувствительными, поскольку производимый свет может улавливаться фотографической пленкой в ​​течение нескольких дней или недель, но их трудно определить количественно, потому что не весь свет, испускаемый реакцией, будет обнаружен.

Обнаружение пероксидаза хрена ферментативная хемилюминесценция (ECL) - распространенный метод обнаружения антител в вестерн-блоттинг. Другой пример - фермент люцифераза, он содержится в светлячках и, естественно, производит свет из своего субстрата люциферина.

Рассеяние света

Статическое рассеяние света измеряет произведение средневзвешенной молярной массы и концентрации макромолекул в растворе. Учитывая фиксированную общую концентрацию одного или нескольких компонентов в течение времени измерения, сигнал рассеяния является прямым измерением средневзвешенной молярной массы раствора, которая будет изменяться в зависимости от образования или диссоциации комплексов. Следовательно, измерение количественно определяет стехиометрию комплексы, а также кинетика. Анализ кинетики белков с помощью светорассеяния - это очень общий метод, для которого не требуется фермент.

Микромасштабный термофорез

Микромасштабный термофорез (MST)[11] измеряет размер, заряд и энтропию гидратации молекул / субстратов в равновесии.[12] Термофоретическое движение флуоресцентно меченого субстрата значительно изменяется, когда он модифицируется ферментом. Эту ферментативную активность можно измерить с высоким временным разрешением в реальном времени.[13] Расход материала полностью оптического метода MST очень низок, требуется всего лишь 5 мкл объема образца и концентрация фермента 10 нМ для измерения констант скорости фермента для активности и ингибирования. MST позволяет аналитикам одновременно измерять модификацию двух разных субстратов (мультиплексирование ), если оба субстрата помечены разными флуорофорами. Таким образом можно проводить эксперименты по конкуренции субстратов.

Прерывистые анализы

Прерывистые анализы - это когда образцы берутся из ферментной реакции через определенные промежутки времени и в этих образцах измеряется количество продукции или потребление субстрата.

Радиометрический

Радиометрические анализы измеряют включение радиоактивность в субстраты или его освобождение от субстратов. В радиоактивные изотопы наиболее часто используемые в этих анализах: 14C, 32П, 35Песок 125I. Поскольку радиоактивные изотопы могут позволить специфическое мечение одиночного атома субстрата, эти анализы чрезвычайно чувствительны и специфичны. Они часто используются в биохимии и часто являются единственным способом измерения конкретной реакции в неочищенных экстрактах (сложных смесях ферментов, образующихся при лизисе клеток).

Радиоактивность обычно измеряется в этих процедурах с помощью сцинтилляционный счетчик.

Хроматографический

Хроматографические анализы измеряют образование продукта путем разделения реакционной смеси на ее компоненты путем хроматография. Обычно это делается высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), но также можно использовать более простой метод тонкослойная хроматография. Хотя для этого подхода может потребоваться много материала, его чувствительность можно повысить, пометив субстраты / продукты радиоактивной или флуоресцентной меткой. Чувствительность анализа также была увеличена за счет переключения протоколов на улучшенные хроматографические инструменты (например, жидкостная хроматография сверхвысокого давления), которые работают при давлении насоса в несколько раз выше, чем инструменты для ВЭЖХ (см. Высокоэффективная жидкостная хроматография # Давление насоса ).[14]

Факторы, которые необходимо контролировать в анализах

Камера давления для измерения активности ферментов при высоком давлении.

На результат анализа влияют несколько факторов, и в недавнем обзоре суммированы различные параметры, которые необходимо контролировать, чтобы анализ продолжал работать.[15]

  • Концентрация соли: Большинство ферментов не переносят чрезвычайно высокие концентрации соли. Ионы мешают слабому ионные связи из белки. Типичные ферменты активны при концентрации соли 1-500 мМ. Как обычно, есть исключения, такие как галофильный водоросли и бактерии.
  • Влияние температуры: Все ферменты работают в диапазоне температур, специфичных для организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции. У увеличения есть предел, потому что более высокие температуры приводят к резкому снижению скорости реакции. Это связано с денатурацией (изменением) белок структура, возникшая в результате разрушения слабых ионный и водородная связь которые стабилизируют трехмерную структуру активного центра фермента.[16] «Оптимальная» температура для ферментов человека обычно составляет от 35 до 40 ° C. Средняя температура для человека 37 ° C. Ферменты человека начинают быстро денатурировать при температуре выше 40 ° C. Ферменты из теплолюбивый археи найденные в горячих источниках стабильны до 100 ° C.[17] Однако идея «оптимальной» скорости ферментативной реакции вводит в заблуждение, так как скорость, наблюдаемая при любой температуре, является произведением двух скоростей: скорости реакции и скорости денатурации. Если бы вы использовали анализ, измеряющий активность в течение одной секунды, он дал бы высокую активность при высоких температурах, однако, если бы вы использовали анализ, измеряющий образование продукта в течение часа, он дал бы вам низкую активность при этих температурах.
  • Влияние pH: Большинство ферментов чувствительны к pH и имеют определенные диапазоны активности. Все имеют оптимальный pH. PH может остановить активность фермента, денатурируя (изменяя) трехмерную форму фермента, нарушая ионный, и водородные связи. Большинство ферментов функционируют при pH от 6 до 8; однако пепсин в желудке лучше всего работает при pH 2, а трипсин - при pH 8.
  • Насыщенность субстрата: Увеличение субстрат концентрация увеличивает скорость реакции (активность фермента). Однако насыщение ферментами ограничивает скорость реакции. Фермент насыщен, когда активные центры всех молекул заняты большую часть времени. В точке насыщения реакция не будет ускоряться, сколько бы дополнительного субстрата ни было добавлено. График скорости реакции выйдет на плато.
  • Уровень скученности, большое количество макромолекулы в решении изменит тарифы и константы равновесия ферментативных реакций через эффект, называемый макромолекулярное скопление.[18]

Список ферментных анализов

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Номенклатурный комитет Международного союза биохимиков (NC-IUB) (1979). «Единицы ферментативной активности». Евро. J. Biochem. 97 (2): 319–20. Дои:10.1111 / j.1432-1033.1979.tb13116.x.
  2. ^ Как много? Словарь единиц измерения Расс Роулетт из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл
  3. ^ а б Шринивасан, Бхарат (27.09.2020). «Совет: обучение кинетике ферментов». Журнал FEBS. Дои:10.1111 / фев.15537. ISSN  1742-464X.
  4. ^ Schnell, S .; Chappell, M.J .; Evans, N.D .; Руссель, М.Р. (2006). «Проблема различимости механизма в биохимической кинетике: реакция с одним ферментом и одним субстратом в качестве примера». Comptes Rendus Biologies. 329 (1): 51–61. Дои:10.1016 / j.crvi.2005.09.005. PMID  16399643.
  5. ^ Шринивасан, Бхарат (08.10.2020). «Явное лечение не Михаэлиса-Ментен и атипичной кинетики при раннем открытии лекарств». dx.doi.org. Получено 2020-10-28.
  6. ^ Шринивасан, Бхарат (27.09.2020). «Совет: обучение кинетике ферментов». Журнал FEBS. Дои:10.1111 / фев.15537. ISSN  1742-464X.
  7. ^ Бергмейер, Х.У. (1974). Методы ферментативного анализа. 4. Нью-Йорк: Academic Press. С. 2066–72. ISBN  0-89573-236-X.
  8. ^ Passonneau, J.V .; Лоури, О. (1993). Ферментативный анализ. Практическое руководство. Тотова, штат Нью-Джерси: Humana Press. С. 85–110.
  9. ^ Менден, Ариана (26 июля 2019 г.). «Быстрый миниатюрный анализ in vitro, разработанный для количественной оценки активности фермента липазы». Журнал ингибирования ферментов и медицинской химии. 34 (1): 1474–1480. Дои:10.1080/14756366.2019.1651312. ЧВК  6713963. PMID  31414611.
  10. ^ Тодд MJ, Гомес J (сентябрь 2001 г.). «Кинетика ферментов, определенная с помощью калориметрии: общий анализ активности ферментов?». Анальный. Биохим. 296 (2): 179–87. Дои:10.1006 / abio.2001.5218. PMID  11554713. S2CID  18567619.
  11. ^ Винкен CJ; и другие. (2010). «Анализы связывания белков в биологических жидкостях с использованием термофореза на микроуровне». Nature Communications. 1 (7): 100. Bibcode:2010 НатКо ... 1..100 Вт. Дои:10.1038 / ncomms1093. PMID  20981028.
  12. ^ Duhr S, Braun D (декабрь 2006 г.). «Почему молекулы движутся по температурному градиенту». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 103 (52): 19678–82. Bibcode:2006PNAS..10319678D. Дои:10.1073 / pnas.0603873103. ЧВК  1750914. PMID  17164337.
  13. ^ Baaske P, Wienken C, Duhr S (2009). "Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik" [Оптически созданный термофорез для биоанализа] (PDF). Биофотоник (на немецком языке): 22–24.[постоянная мертвая ссылка ]
  14. ^ Черчвелл, М; Twaddle, N; Микер, L; Дёрге, Д. (октябрь 2005 г.). «Повышение чувствительности жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии». Журнал хроматографии B. 825 (2): 134–143. Дои:10.1016 / j.jchromb.2005.05.037. PMID  16002352.
  15. ^ Сринивасан Б., Кантаэ В., Робинсон Дж. И др. (Апрель 2020 г.). «Воскрешая феникса: когда проба не удалась». Обзоры медицинских исследований. 0: 0. Дои:10.1002 / med.21670. HDL:10289/3552. PMID  32285494.
  16. ^ Дэниэл Р.М., Петерсон М.Э., Дэнсон М.Дж. и др. (Январь 2010 г.). «Молекулярные основы влияния температуры на активность ферментов». Biochem. J. 425 (2): 353–60. Дои:10.1042 / BJ20091254. HDL:10289/3552. PMID  19849667.
  17. ^ Коуэн Д.А. (1997). «Термофильные белки: стабильность и функции в водных и органических растворителях». Комп. Biochem. Physiol. Физиол. 118 (3): 429–38. Дои:10.1016 / S0300-9629 (97) 00004-2. PMID  9406427.
  18. ^ Минтон А.П. (2001). «Влияние макромолекулярного скопления и макромолекулярного ограничения на биохимические реакции в физиологических средах». J. Biol. Chem. 276 (14): 10577–80. Дои:10.1074 / jbc.R100005200. PMID  11279227.

внешняя ссылка