QPNC-PAGE - QPNC-PAGE

QPNC-PAGE, или же количественный препаративный нативный непрерывный электрофорез в полиакриламидном геле, является биоаналитическим, с высоким разрешением и точный техника применяется в биохимия и биоинорганическая химия разделять белки количественно изоэлектрическая точка. Этот стандартизированный вариант родного гель-электрофорез используется биологи для выделения биомакромолекул в растворе, например, активном или родные металлопротеины в биологических образцы или правильно и неправильно сложенный металл кофактор -содержащие белки или изоформы белка в сложном белке смеси.[1]

Вступление

Белки выполняют несколько функций в жизнь организмы, включая каталитический реакции и транспорт молекулы или же ионы в пределах клетки, то органы или весь тело. Понимание процессы в человеческих организмах, которые в основном обусловлены биохимические реакции и белок-белковые взаимодействия, в значительной степени зависит от нашей способности выделять активные белки в биологических образцах для более детального изучения химических структура и физиологический функция. Это существенное Информация может означать важное указание на пациент состояние здоровье.[2]

Поскольку около 30-40% всех известных белков содержат один или несколько кофакторы ионов металлов (например., церулоплазмин, ферритин, белок-предшественник амилоида, матричная металлопротеиназа ), особенно нативные металлопротеины, должны быть выделены, идентифицированы и количественно определены после жидкая биопсия. Многие из этих кофакторов (например, утюг, медь, или же цинк ) играют ключевую роль в жизненно важных ферментативный каталитические процессы или стабилизировать глобулярный белок молекулы.[3] Следовательно, высокоточный электрофорез и другие родные разделение техники очень важны в качестве начального шага белок и анализ состава следов металлов, затем масс-спектрометрический и магнитный резонанс методы для количественной оценки и определения растворимый представляющие интерес белки.[4]

Метод

Механизмы разделения и буферизации

Оборудование для аналитического электрофореза: камера электрофореза, перистальтический насос, коллектор фракций, буферный рециркуляционный насос и УФ-детектор (в холодильнике), блок питания и регистратор (на столе)

В гель-электрофорезе белки обычно разделяются обвинять, размер, или же форма. Цель изоэлектрическая фокусировка (IEF), например, заключается в разделении белков в соответствии с их изоэлектрической точкой (pI), то есть в соответствии с их зарядом при разных pH значения.[5] Здесь тот же механизм реализуется в имеющейся в продаже камере для электрофореза (см. Рисунок Оборудование) для разделения заряжен биомолекулы, Например, супероксиддисмутаза (SOD)[6] или же аллергены,[7] в условиях постоянного pH и разных скоростей миграции в зависимости от разных изоэлектрических точек. Разделенные (металлические) белки элюировать последовательно, начиная с самого низкого (pI> 2-4) и заканчивая самым высоким pI (pI <10,0) присутствующих белковых молекул.

Благодаря специфическим свойствам приготовленного геля и электрофорезу буферный раствор (который базовый и содержит Трис -HCl и NaN3 ), большинство белков биологическая система (например., Helicobacter pylori[8]) заряжены в растворе отрицательно и будут мигрировать из катод к анод из-за электрическое поле. На аноде электрохимически -сгенерированный водород ионы реагируют с молекулами Трис с образованием одновалентный Трис-ионы. Положительно заряженные ионы трис мигрируют через гель к катоду, где они нейтрализовать гидроксид ионы с образованием молекул Трис и воды. Таким образом, буферный механизм на основе Триса обеспечивает постоянный pH в буферной системе.[9] При 25 ° C Трис-буфер имеет эффективный диапазон pH от 7,5 до 9,0. В приведенных здесь условиях (с учетом концентрации, механизма буферизации, pH и температуры) эффективный pH смещается в диапазоне примерно от 10,0 до 10,5. Все собственные буферные системы имеют низкий проводимость и диапазон pH от 3,8 до 10,2. Для разделения белков в соответствии с их pI используются непрерывные нативные буферные системы.[10]

Хотя значение pH (10,00) буфера для электрофореза не соответствует физиологический pH значение в ячейке или ткань типа, разделенные кольцеобразные белковые полосы непрерывно элюируются физиологическим буферным раствором (pH 8,00) и выделяются в различных фракции (см. рисунок Электрофореграмма).[11] При условии, что необратимые денатурация не может быть продемонстрировано (независимой процедурой), большинство молекул белка стабильны в водном растворе при значениях pH от 3 до 10, если температура ниже 50 ° C.[12] Поскольку Джоулево тепло и температура, возникающая во время электрофореза, может превышать 50 ° C,[13] и, таким образом, оказывают негативное влияние на стабильность и поведение белков при миграции, система разделения, включая камеру для электрофореза и коллектор фракций, охлаждается в холодильнике до 4 ° C. Перегреву геля препятствует внутреннее охлаждение гелевой колонки и создание постоянного мощность (см. рисунок Оборудование).

Свойства геля и время полимеризации

Наилучшие условия полимеризации акриламидных гелей достигаются при 25-30 ° C.[14] и полимеризация, кажется, прекращается через 20-30 мин реакции, хотя остаточная мономеры (10-30%) обнаруживаются по истечении этого времени.[15] Сополимеризация мономера акриламида (АК) /N, N'-метиленбисакриламид (Bis-AA) сшивающий агент, инициированный персульфат аммония (APS) /тетраметилэтилендиамин (TEMED) реакции наиболее эффективны при щелочном pH. Таким образом, акриламидные цепи образуются и сшиваются одновременно. Благодаря свойствам буфера для электрофореза полимеризация геля проводится при pH 10,00, обеспечивая эффективное использование TEMED и APS в качестве катализаторы реакции полимеризации, и одновременно подавление конкурентной гидролиз произведенного акриламида полимер сеть. В противном случае белки могут быть модифицированы реакцией с неполимеризованными мономерами акриламида, образуя ковалентный акриламид приведение продукты, которые могут привести к появлению нескольких полос.[16]

Кроме того, время полимеризации геля может напрямую влиять на время пика элюирования разделенных металлопротеинов в электрофореграмма из-за сжатия и расширения гелей и их пор с более длительным временем инкубации (см. рисунок Электрофореграмма, ср. Воспроизводимость и восстановление). Чтобы обеспечить максимальную воспроизводимость размера пор геля и получить полностью полимеризованный и неограничивающий гель с большими порами для анализа PAGE, полиакриламидный гель полимеризуется в течение 69 часов при комнатная температура (RT). В экзотермический тепло, выделяемое в процессе полимеризации, составляет рассеянный постоянно, в то время как температура может быстро подняться до более 75 ° C в первые минуты, после чего медленно падает.[17] Через 69 часов гель достиг комнатной температуры и, следовательно, находится в самой низкой точке. энергия состояние, потому что химические реакции и гелеобразование прекращены. Гелеобразование означает, что растворитель (вода) иммобилизуется внутри полимерной сетки с помощью водородные связи а также силы Ван дер Ваальса. В результате приготовленный гель однородный (в условиях однородного распределения перекрестные ссылки во всем образце геля[18]), стабильный по своей природе и не содержащий мономеров или радикалы. Свежие полиакриламидные гели дополнительно гидрофильный, электрически нейтральны и не связывают белки.[19] Эффекты рассева из-за сила тяжести -индуцированный сжатие геля можно исключить по тем же причинам. В среде без свойств молекулярного сита можно ожидать высокого разрешения.[20]

Перед запуском электрофоретического прогона предварительно прогоняют подготовленный гель с 4% Т (общее содержание полимера (Т)), 2,67% С (концентрация сшивающего агента (С)) для его уравновешивания. Он практически не просеивает и оптимален для электрофореза белков с концентрацией выше или равной 200 kты (ср. электрофорез в агарозном геле ). Белки мигрируют в нем более или менее на основе их свободной подвижности.[21] Поэтому взаимодействия геля с биомолекулами пренебрежимо малы, и, таким образом, белки разделяются чисто и предсказуемо при времени полимеризации 69 часов (см. рисунок Электрофореграмма). Разделенные металлопротеины, включая биомолекулы в диапазоне от примерно <1 ku до более 30 ku (например, металл шапероны, прионы, белки транспорта металлов, амилоиды, металлоферменты, металлопептиды, металлотионеин, фитохелатины ) не диссоциированы на апопротеины и металлические кофакторы.[22]

Воспроизводимость и восстановление

Электрофореграмма показывает четыре прогона PAGE родного хроматографически предварительно очищенный высокомолекулярный белок кадмия (≈ 200 ku) в качестве функция от времени полимеризации геля (4% Т, 2,67% С). Метод определения кофакторов Cd (в мкг / л): GF-AAS

Биоактивные структуры (нативные или 3D конформация или форма) изолированных белковых молекул не претерпевают каких-либо значительных конформационные изменения. Таким образом, белки, содержащие активный металлический кофактор, могут быть выделены воспроизводимо в тех же фракциях после анализа в ПААГ (см. Рисунок Электрофореграмма). Сдвиг пика на соответствующей электрофореграмме может указывать на то, что стандартизованное время полимеризации геля (69 часов, RT) не реализуется в PAGE. эксперимент. Более низкое отклонение стандартизованного времени полимеризации (<69 часов) означает неполную полимеризацию и, таким образом, внутреннюю нестабильность из-за размягчения геля во время сшивания полимеров, когда материал достигает равновесия набухания,[23] тогда как превышение этого срока (> 69 часов) является показателем старения геля.[24] Явление старения геля тесно связано с долгосрочным вязкость уменьшение водных растворов полиакриламида[25] и повышенное набухание гидрогелей.[26]

В стандартных условиях (69 часов) металлопротеины с различными диапазонами молекулярных масс и изоэлектрических точек были восстановлены в биологически активной форме с количественным выходом более 95%.[27] Подготовительным SDS электрофорез в полиакриламидном геле стандартные белки (цитохром с, альдолаза, овальбумин и бычий сывороточный альбумин ) с молекулярными массами 14-66 ку может быть извлечен со средним выходом около 73,6%.[28] Подготовительный изотахофорез (ITP) применяется для изоляции палладий -содержащие белки с молекулярными массами 362 ку (выход 67%) и 158 ку (выход 97%).[29]

Количественная оценка и идентификация

Физиологические концентрации (ppb -диапазон) Fe, Cu, Zn, Ni, Пн, Pd, Co, Mn, Pt, Cr, CD и другие металлические кофакторы могут быть идентифицированы и абсолютно количественно определены в аликвота доли на масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС)[30] или полное отражение Рентгеновская флуоресценция (TXRF),[31] Например. В случае ICP-MS структурная информация связанных металлобиомолекул[32] безвозвратно потеряно из-за ионизация образца с плазма.[33] Другой установленный высокочувствительный метод обнаружения для определения (следа) элементы - атомно-абсорбционная спектрометрия в графитовой печи (GF-AAS) (см. рисунок Электрофореграмма).[34] Благодаря высокой чистоте и оптимизации концентрация разделенных металлопротеинов, например, терапевтического рекомбинантного фармацевтические препараты растительного происхождения Такие как медный шаперон для супероксиддисмутазы (CCS) из лекарственные растения, в нескольких конкретных фракциях PAGE, родственные структуры этих аналиты можно выяснить количественно, используя решение ЯМР-спектроскопия в неденатурирующих условиях.[35]

Приложения

Неправильно свернутые металлические белки, например CCS или Cu / Zn-супероксиддисмутаза (SOD1) присутствует в мозг, кровь или другие клинические образцы, указывают на нейродегенеративные заболевания как болезнь Альцгеймера (БА) или боковой амиотрофический склероз (БАС).[36] Активные молекулы CCS или SOD способствуют внутриклеточному гомеостатический контроль над ионами основных металлов (например, Cu1+/2+, Zn2+, Fe2+/3+, Mn2+, Ni3+) в организмах, и, таким образом, эти биомолекулы могут уравновешивать про-окислительный и антиоксидантные процессы в цитоплазма. В противном случае свободные (слабосвязанные) ионы переходных металлов участвуют в Фентоноподобные реакции в каком вредном гидроксильный радикал образуется, что без сдерживания будет разрушительно для белков.[37] Потеря (активного) CCS увеличивает амилоид-β производство в нейроны что, в свою очередь, является основным патологическим признаком AD.[38] В связи с этим предполагается, что шаперон меди для супероксиддисмутазы является одним из наиболее перспективных. биомаркеры Cu токсичность при этих заболеваниях.[39] CCS следует анализировать в первую очередь в крови, поскольку метаанализ из сыворотка данные показали, что у пациентов с БА уровень Cu в сыворотке выше, чем у здоровых людей.[40]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Зелерт Х, Краузе Ф (2008). «Препаративное выделение белковых комплексов и других биочастиц путем элюирования из полиакриламидных гелей». Электрофорез. 29 (12): 2617–36. Дои:10.1002 / elps.200800061. PMID  18494038. S2CID  35874355.
  2. ^ Сварт С., Якубовский Н. (2016). «Обновленная информация о состоянии метрологии металлопротеинов». Журнал аналитической атомной спектрометрии. 31 (9): 1756–65. Дои:10.1039 / C6JA00181E.
  3. ^ Финни Л.А., О'Халлоран ТВ (2003). «Переходные металлы в клетке: выводы из химии рецепторов ионов металлов». Наука. 300 (5621): 931–6. Bibcode:2003Наука ... 300..931F. Дои:10.1126 / science.1085049. PMID  12738850. S2CID  14863354.
  4. ^ Cerchiaro G, Manieri TM, Bertuchi FR (2013). «Аналитические методы количественного определения меди, цинка и железа в клетках млекопитающих». Металломика. 5 (10): 1336–45. Дои:10.1039 / c3mt00136a. PMID  23925479.
  5. ^ Гарфин Д.Е. (1990). Изоэлектрическая фокусировка. Методы в энзимологии. 182. С. 459–77. Дои:10.1016/0076-6879(90)82037-3. ISBN  9780121820831. PMID  2314254.
  6. ^ Youn HD, Ким EJ, Роу JH, Hah YC, Кан СО (1996). «Новая никельсодержащая супероксиддисмутаза из Streptomyces spp». Биохимический журнал. 318 (Pt 3): 889–96. Дои:10.1042 / bj3180889. ЧВК  1217701. PMID  8836134.
  7. ^ Сосать Р., Петерсен А., Вебер Б., Фибиг Н., Кромвель О. (2004). «Аналитический и препаративный электрофорез в нативном полиакриламидном геле: исследование рекомбинантного и природного основного аллергена пыльцы трав Phl p 2». Электрофорез. 25 (1): 14–9. Дои:10.1002 / elps.200305697. PMID  14730563. S2CID  20585733.
  8. ^ Бэ С.Х., Харрис А.Г., Хайнс П.Г., Чен Х., Гарфин Д.Е., Хазелл С.Л., Пайк Ю.К., Уолш Б.Дж., Кордвелл С.Дж. (2003). «Стратегии обогащения и идентификации основных белков в протеомных проектах». Протеомика. 3 (5): 569–79. Дои:10.1002 / pmic.200300392. PMID  12748937. S2CID  26482563.
  9. ^ Кастенхольц Б (2006). «Сравнение электрохимического поведения высокомолекулярных белков кадмия в Arabidopsis thaliana и овощных растениях при использовании препаративного нативного непрерывного электрофореза в полиакриламидном геле (PNC-PAGE)». Электроанализ. 18 (1): 103–6. Дои:10.1002 / elan.200403344.
  10. ^ Маклеллан Т (1982). «Буферы для электрофореза полиакриламидных гелей при различных значениях pH». Аналитическая биохимия. 126 (1): 94–9. Дои:10.1016/0003-2697(82)90113-0. PMID  7181120.
  11. ^ Кастенхольц Б, Гарфин Д.Е. (2010). «Выделение кислых, основных и нейтральных металлопротеинов с помощью QPNC-PAGE». Природа предшествует: 1–4. Дои:10.1038 / npre.2010.4617.1.
  12. ^ Гордон А.Х. (1969). Электрофорез белков в полиакриламидных и крахмальных гелях (Часть I, Глава 2 Акриламидный гель). Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии. 1. С. 34–45. Дои:10.1016 / S0075-7535 (08) 70324-3. ISBN  9780444533418.
  13. ^ Вулли П. (1987). «Термическая нестабильность гелей для электрофореза». Электрофорез. 8 (8): 339–45. Дои:10.1002 / elps.1150080802. S2CID  97116687.
  14. ^ Гельфи Ч., Ригетти П.Г. (1981). «Кинетика полимеризации полиакриламидных гелей II. Влияние температуры». Электрофорез. 2 (4): 220–28. Дои:10.1002 / elps.1150020405. S2CID  93109120.
  15. ^ Чен Б., Чрамбах А. (1979). «Оценка эффективности полимеризации при образовании полиакриламидного геля с использованием непрерывного оптического сканирования во время полимеризации». Журнал биохимических и биофизических методов. 1 (2): 105–16. Дои:10.1016 / 0165-022X (79) 90017-4. PMID  551105.
  16. ^ Бонавентура С., Бонавентура Дж., Стивенс Р., Миллингтон Д. (1994). «Акриламид в полиакриламидных гелях может модифицировать белки во время электрофореза». Аналитическая биохимия. 222 (1): 44–8. Дои:10.1006 / abio.1994.1451. PMID  7856869.
  17. ^ Уитли MA, Филлипс CR (1983). «Температурные эффекты при полимеризации полиакриламидных гелей, используемых для иммобилизации бактериальных клеток». Биотехнологии и биоинженерия. 25 (2): 623–6. Дои:10.1002 / бит. 260250228. PMID  18548679.
  18. ^ Кизилай М.Ю., Хорошо O (2003). «Влияние гидролиза на пространственную неоднородность полиакриламидных гелей различной плотности сшивки». Полимер. 44 (18): 5239–50. Дои:10.1016 / S0032-3861 (03) 00494-4.
  19. ^ Гарфин Д.Е. (2009). «25-е ежегодное собрание Американского общества электрофореза». Экспертный обзор протеомики. 6 (3): 239–41. Дои:10.1586 / epr.09.18. PMID  19489696. S2CID  24490398.
  20. ^ Hjertén S (1963). ""Молекулярно-сито «Электрофорез в сшитых полиакриламидных гелях». Журнал хроматографии А. 11: 66–70. Дои:10.1016 / S0021-9673 (01) 80870-0. PMID  13954823.
  21. ^ Гарфин Д.Е. (2009) [1990]. «Глава 29 одномерный гель-электрофорез». Руководство по очистке белков, 2-е издание. Методы в энзимологии. 463. С. 497–513. Дои:10.1016 / S0076-6879 (09) 63029-9. ISBN  978-0-12-374536-1. PMID  19892189.
  22. ^ Фитри Н., Кастенхольц Б., Бухари Б., Амран МБ, Варганегара FM (2008). «Видообразование молибдена в сыром соке флоэмы клещевины». Аналитические письма. 41 (10): 1773–84. Дои:10.1080/00032710802162442. S2CID  95715133.
  23. ^ Дамлянович В., Лагерхольм BC, Якобсон К. (2005). «Конъюгация белков внеклеточного матрикса с характерными полиакриламидными субстратами для анализа механотрансдукции клеток». Биотехнологии. 39 (6): 847–51. Дои:10.2144/000112026. PMID  16382902.
  24. ^ Стейскал Дж., Гордон М., Торкингтон Дж. А. (1980). «Распад полиакриламидных гелей». Полимерный бюллетень. 3 (11): 621–5. Дои:10.1007 / BF01135333. S2CID  98565268.
  25. ^ Кулике WM, Kniewske R, Klein J (1982). «Приготовление, характеристика, свойства раствора и реологические свойства полиакриламида». Прогресс в науке о полимерах. 8 (4): 373–468. Дои:10.1016/0079-6700(82)90004-1.
  26. ^ Юн Дж, Цай С., Су Зи, Хейворд Р.С. (2010). «Кинетика пороупругого набухания тонких слоев гидрогеля: сравнение теории и эксперимента». Мягкая материя. 6 (23): 6004–12. Bibcode:2010SMat .... 6.6004Y. Дои:10.1039 / C0SM00434K. S2CID  2867196.
  27. ^ Кастенхольц Б (2006). «Важный вклад новой процедуры количественного препаративного нативного непрерывного электрофореза в полиакриламидном геле (QPNC-PAGE) для выяснения метаболизма металлических кофакторов при заболеваниях, связанных с неправильным сворачиванием белков - теория». Буквы о белках и пептидах. 13 (5): 503–8. Дои:10.2174/092986606776819637. PMID  16800806.
  28. ^ Охаши Т., Моритани С., Андох Х, Сато С., Омори С., Лотцпейч Ф., Икеда М. (1991). «Препаративное электроэлюирование белков с высоким выходом после разделения электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и его применение для анализа аминокислотных последовательностей и повышения уровня антител». Журнал хроматографии. 585 (1): 153–9. Дои:10.1016 / 0021-9673 (91) 85069-р. PMID  1666109.
  29. ^ Вебер Г, Мессершмидт Дж, фон Болен А, Кастенхольц Б, Гюнтер К. (2004). «Улучшенное разделение разновидностей палладия в биологических матрицах за счет использования комбинации гель-проникающей хроматографии и изотахофореза». Электрофорез. 25 (12): 1758–64. Дои:10.1002 / elps.200305833. PMID  15213973. S2CID  22292130.
  30. ^ Рашовский П. (2011). «Использование колоночного гель-электрофореза для онлайн-подключения к ICP-MS для металлопротеомики». Архив диссертаций, Университет Масарика, Брно.
  31. ^ Пессана С., Карвалью М.Л., Беккер М., фон Болен А. (2010). «Количественное определение тяжелых металлов на различных стадиях производства вина с помощью рентгеновской флуоресценции полного отражения и рентгеновской флуоресценции с дисперсией энергии: сравнение на двух виноградниках». Spectrochimica Acta Часть B Атомная спектроскопия. 65 (6): 504–7. Bibcode:2010AcSpe..65..504P. Дои:10.1016 / j.sab.2010.04.003.
  32. ^ Якубовский Н., Лобинский Р., Моэнс Л. (2004). «Металлобиомолекулы. Основа жизни, проблема атомной спектроскопии». Журнал аналитической атомной спектрометрии. 19 (1): 1–4. Дои:10.1039 / B313299B.
  33. ^ Mounicou S, Szpunar J, Lobinski R (2009). «Металломика: понятие и методология». Обзоры химического общества. 38 (4): 1119–38. Дои:10.1039 / B713633C. PMID  19421584.
  34. ^ Линь TW, Хуанг SD (2001). «Прямое и одновременное определение меди, хрома, алюминия и марганца в моче с помощью атомно-абсорбционного спектрометра с многоэлементной графитовой печью». Аналитическая химия. 73 (17): 4319–25. Дои:10.1021 / ac010319h. PMID  11569826.
  35. ^ Kastenholz B, Garfin DE (2009). «Лекарственные растения: естественный источник шаперонов для лечения неврологических расстройств». Буквы о белках и пептидах. 16 (2): 116–20. Дои:10.2174/092986609787316234. PMID  19200033.
  36. ^ Schümann K, Classen HG, Дитер HH, König J, Multhaup G, Rükgauer M, Summer KH, Bernhardt J, Biesalski HK (2002). "Мастерская консенсуса Хоэнхайма: медь". Европейский журнал клинического питания. 56 (6): 469–83. Дои:10.1038 / sj.ejcn.1601315. PMID  12032645.
  37. ^ Робинсон, штат Нью-Джерси, Winge DR (2010). «Металло-шапероны меди». Ежегодный обзор биохимии. 79: 537–62. Дои:10.1146 / annurev-biochem-030409-143539. ЧВК  3986808. PMID  20205585.
  38. ^ Грей Э.Х., Де Вос К.Дж., Дингуолл К., Перкинтон М.С., Миллер С.К. (2010). «Дефицит медного шаперона для супероксиддисмутазы увеличивает производство амилоида-β». Журнал болезни Альцгеймера. 21 (4): 1101–5. Дои:10.3233 / JAD-2010-100717. ЧВК  3023902. PMID  20693630.
  39. ^ Pal A (2014). «Токсичность меди, вызванная гепатоцеребральными и нейродегенеративными заболеваниями: острая необходимость в прогностических биомаркерах». Нейротоксикология. 40: 97–101. Дои:10.1016 / j.neuro.2013.12.001. PMID  24342654.
  40. ^ Букосси С., Вентрилья М., Панетта В., Салюстри С., Паскуалетти П., Мариани С., Сиотто М., Россини П.М., Сквитти Р. (2011). «Медь при болезни Альцгеймера: метаанализ исследований сыворотки, плазмы и спинномозговой жидкости». Журнал болезни Альцгеймера. 24 (1): 175–85. Дои:10.3233 / JAD-2010-101473. PMID  21187586. S2CID  33194620.

внешняя ссылка